Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine standardisierte Nachbeobachtung des in vivo-Verhaltens von in das Maushirn transplantierten Stammzellen zu erreichen. Dies wird erreicht, indem zunächst die aus dem Knochenmark stammenden stromalen Zellen, die EGFP und Luciferase koexprimieren, mit fluoreszierenden eisenoxidhaltigen Mikroteilchen markiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die mit MPIO markierten BMCs gezielt in das Gehirngewebe der Maus zu injizieren.

Anschließend werden Überleben und Lokalisation der Zelltransplantate nichtinvasiv mittels Biolumineszenz-Bildgebung und Magnetresonanztomographie verfolgt. Der letzte Schritt besteht darin, die Ergebnisse der in vivo-Bildgebung durch histologische Analysen an Leichengewebe zu validieren. Diese Methode kann Einblicke in das Verhalten von Stammzellen nach Transplantation in das Mausgehirn geben, kann aber auch auf andere Systeme wie Modellorganismen und Krankheitsstudien angewendet werden.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Handhabung der Tiere schwierig zu erlernen ist, weil intravenöse und intrazerebrale Injektionen anspruchsvoll sind und bestimmte Risiken für das Überleben der Tiere beinhalten. Um dieses Verfahren zu beginnen, geben Sie 75 × 10⁶ eisblaue Eisenoxidpartikel im Mikrometerbereich zu einer subkonfluent wachsenden Zellkultur hinzu. Inkubieren Sie sie weitere 16 Stunden, um die Partikelaufnahme mittels Endozytose zu ermöglichen, und waschen Sie anschließend die verbleibenden Partikel weg.

Lassen Sie die Zellen weitere 24 Stunden wachsen, um eine Zellkonfluenz und eine homogene Verteilung des G-B-M-P-I-O zu erreichen. Danach validieren Sie den Partikeleintrag visuell mittels Fluoreszenzmikroskopie, indem Sie das Verhältnis der EGFP-positiven und G-B-M-P-I-O-positiven Zellen zur Gesamtanzahl der EGFP-positiven Zellen berechnen. Anschließend waschen Sie die mit G-B-M-P-I-O markierten BMSC-Luciferase-EGFP-Zellen zweimal mit je 10 Milliliter.

PBS die Zellen mit Trypsin-EDTA behandeln und anschließend ernten. Danach die Zellen waschen und in PBS auf eine Endkonzentration von 133 × 10⁶ Zellen pro Milliliter resuspendieren. Schließlich die Zellen bis zur Transplantation auf Eis lagern.

In diesem Verfahren betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion eines Gemischs aus Ketamin mit 80 Milligramm pro Kilogramm und Xylazin mit 16 Milligramm pro Kilogramm. Warten Sie fünf Minuten, bis die Maus eingeschlafen ist, und rasieren Sie anschließend ihren Kopf, um sterile Eingriffe zu ermöglichen. Danach stellen Sie die Maus in einen stereotaktischen Halter und desinfizieren die Haut mit Alkohol.

Anschließend Salbe auf die Augen auftragen, um Austrocknung zu verhindern. Eine mediane Kopfhautinzision vornehmen, um den Schädel freizulegen, um gezielt auf das Hippocampus zu arbeiten. Mit einem zahnmedizinischen Bohrer ein Loch in den Schädel bohren, zwei Millimeter posterior und zwei Millimeter lateral.

Zu diesem Zeitpunkt die Zellsuspension kurz vortexen und anschließend die Zellsuspension in die Spritze aufziehen. Danach die Nadelspritze bis auf eine Tiefe von 2,5 Millimetern unter die Dura absenken und für eine Minute eine Druckausgleichsphase einlegen. Nach einer Minute die Nadel auf eine Position von zwei Millimetern unter der Dura zurückziehen.

Anschießend injizieren Sie drei Mikroliter Zellsuspension mithilfe einer automatisierten Mikroinjektionspumpe mit einer Geschwindigkeit von 0,70 Mikrolitern pro Minute. Warten Sie nach der Injektion weitere fünf Minuten, um einen Rückfluss der injizierten Zellsuspension zu verhindern. Ziehen Sie danach die Nadel langsam zurück.

Anschließend desinfizieren Sie die Hautränder und nähen Sie die Haut. Injizieren Sie 300 Mikroliter einer 0,9 %igen Natriumchloridlösung subkutan, um einer Dehydrierung vorzubeugen. Am Ende stellen Sie die Maus unter eine Wärmelampe, um die Erholung von der Anästhesie zu ermöglichen und die Biolumineszenz-Bildgebung durchzuführen.

Narkotisieren Sie die Maus mit einer Mischung aus 3 % Iso, Fluor und Sauerstoff. Anschließend platzieren Sie die Maus im Photonendetektor. Verringern Sie die Anästhesietiefe, indem Sie das Iso-Fluor auf 1,5 % einstellen. Danach injizieren Sie d-Luciferin intravenös mit 150 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht.

Bilden Sie fünf Minuten lang mit der Photo-Vision-Software auf. Führen Sie danach eine Bildverarbeitung mit der M-three-Vision-Software durch und quantifizieren Sie das beobachtete Signal mithilfe fester interessierender Bereiche. Führen Sie zur Durchführung der Magnetresonanztomographie eine Anästhesie der Maus mit 3 % ISO-Fluor in einer Mischung aus Sauerstoff und Distickstoffmonoxid durch.

Danach die Maus in den Halter eines horizontalen 9,4 Tesla-MR-Systems bringen. Die Anästhesietiefe reduzieren, indem man den Isofluran auf 1 % einstellt. Anschließend Augensalbe auf die Augen der Maus auftragen, um Austrocknung zu verhindern. Danach die Körpertemperatur mittels eines rektalen Probes messen.

Platzieren Sie dann einen Sensor unterhalb des Bauchs der Maus, um die Atemfrequenz zu überwachen. Halten Sie die Atemfrequenz bei 110 ± 10 Atemzügen pro Minute und die Körpertemperatur innerhalb eines engen Bereichs von 37 ± 0,5 °C konstant. Bringen Sie anschließend die oberflächliche HF-Spule auf dem Kopf der Maus an.

Platzieren Sie die Maus in der Mitte des Magneten. Öffnen Sie anschließend ParaVision 5.1 und stellen Sie die Sequenzparameter gemäß der beigefügten Publikation ein. Erwerben Sie dann einen Satz von 10 koronalen T2-gewichteten Spin-Echo-Bildern, um spezifische anatomische Informationen zu erhalten.

NT-Zweifach-Gradientenecho-Bilder mit gewichteter Echozeit, um die Wanderung von Stammzellen mit einer in der Ebene liegenden Auflösung von 70 Quadratmikrometern zu untersuchen. In diesem Schritt das Tier opfern und das Gehirn entnehmen. Das Gehirngewebe zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 4 % Paraldehyd in PBS fixieren.

Nach zwei Stunden. Dehydrieren Sie das Hirngewebe, indem Sie es in unterschiedliche Saccharose-Gradienten bei vier Grad Celsius geben. Am nächsten Tag gefrieren Sie das Hirngewebe mit flüssigem Stickstoff ein und lagern es bei minus 80 Grad Celsius, bis es zum Schneiden bereit ist.

Schneiden Sie das Gehirngewebe in 10 Mikrometer dicken Schnitten mit einem Kryostaten. Anschließend untersuchen Sie die ungefärbten Kryoschnitte unter einem Fluoreszenzmikroskop auf blaue Fluoreszenz der G-B-M-P-I-O-Partikel und grüne Fluoreszenz der EGFP-exprimierenden Zellen. Danach prüfen Sie die ungefärbten Kryoschnitte auf grünrote Hintergrundfluoreszenz der entzündlichen Zellen.

Das beschriebene Glacial-Blue-MPIO-Markierungsverfahren führt zu einer hochgradig effizienten Markierung von BMSC-Luciferase-EGFP-Zellen, was leicht mittels Fluoreszenzmikroskopie überprüft werden kann. Anschließend kann nach der Transplantation der mit G-B-M-P-I-O markierten BMSC-Luciferase-EGFP-Zellen im zentralen Nervensystem von Mäusen das Überleben des Zelltransplantats mittels In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung basierend auf der Luciferase-Aktivität überwacht werden. Zusätzlich kann die exakte Lokalisation der transplantierten Zellen mittels In-vivo-Magnetresonanztomographie anhand des Eisengehalts der Glacial-Blue-MPIO verfolgt werden.

Schließlich zeigt die histologische Analyse die Validierung der mittels Biolumineszenzbildgebung und Magnetresonanztomographie erzielten Ergebnisse. Die stabile Überlebensfähigkeit wurde durch einen zeitlich stabilen EGFP-Ausdruck nach der Entwicklung bestätigt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der molekularen Bildgebung den Weg, zelluläre und molekulare Vorgänge nach der Stammzelltransplantation in verschiedenen Tiermodellen neurodegenerativer Erkrankungen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie molekulares Imaging durchgeführt wird, unter Anwendung von Biolumineszenz- und Magnetresonanztomographie, und wie in-vivo-Ergebnisse angemessen durch postmortale histologische Untersuchungen validiert werden können.