Überwachen von Änderungen in der intrazellulären Calcium-Konzentration und Synaptic Wirksamkeit in der Muschel

Intrazelluläres Kalzium wurde als wichtiger Bestandteil mehrerer Mechanismen der synaptischen Plastizität diskutiert. Diese Vorstellungen können geprüft werden, indem gleichzeitig Veränderungen des Kalziums und Modifikationen der synaptischen Wirksamkeit überwacht werden. Hier zeigen wir, wie dies durch die Kombination von Kalzium-Bildgebung mit intrazellulärer Ableitung erreicht wird.

Unsere Experimente werden mit einem Ganglion des Weichtiers Aplysia californica durchgeführt. Dieses Präparat bietet mehrere Vorteile wie große identifizierte Neuronen, die für Aplysia natürlichen niedrigen Temperaturen, langsame Signale und eine erleichterte Bildgebung, doch die hier demonstrierten allgemeinen Techniken lassen sich problemlos auf andere Systeme übertragen. Hallo, ich bin Colin Evans im Labor von Elizabeth Cropper an der Fishburg-Abteilung für Neurowissenschaften und dem Freedman Brain Institute an der Mount Sinai School of Medicine in New York City.

Heute werden wir die simultane Abbildung von Änderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration und der synaptischen Wirksamkeit im bukkalen Ganglion des Weichtiers Aplysia cahora demonstrieren. Um intrazelluläres Kalzium nachzuweisen, injizieren wir eine präsynaptische Nervenzelle mit dem zellpermeablen Kalziumindikatorfarbstoff Calcium Orange. Anschließend wird das Präparat unter das Mikroskop gebracht, und die prä- und postsynaptischen Neuronen werden mit scharfen Elektroden impaliert.

Wiederholte präsynaptische Stimulation führt zu einer verstärkten postsynaptischen Antwort, die als zunehmende postsynaptische Potential- oder PSP-Amplitude sichtbar ist. Die Messung des fluoreszierenden Signals des Kalziumindikatorfarbstoffs ermöglicht es uns, gleichzeitige Änderungen des intrazellulären Kalziums im präsynaptischen Bereich nachzuweisen. Um zu beginnen, betäuben Sie ein erwachsenes Tier mit einem Gewicht von etwa 150 Gramm, indem Sie 75 ml isotonische Magnesiumchloridlösung injizieren, heften Sie das betäubte Tier auf eine mit Wachs bedeckte Schale und machen Sie dann mit groben Pinzetten und einer Schere einen Schnitt im Fuß des Tieres, um die bukkale Masse freizulegen.

Das bukkale Ganglion liegt auf der ventralen Seite der bukkalen Masse und besteht aus zwei verbundenen Hemiganglien. Es enthält mehrere hundert Neuronen, die zusammen mit Neuronen in anderen Ganglien zur Erzeugung und Steuerung des Fressverhaltens des Tieres beitragen. Lösen Sie das Ganglion vorsichtig, indem Sie alle eingeklemmten Nerven mit feiner Schere durchtrennen, und entfernen Sie es aus dem Tier.

Dann fixieren Sie das freigelegte Ganglion an der Basis einer mit Silikon beschichteten Schale, die mit künstlichem Meerwasser gefüllt ist. Das Ganglion ist von einer Hülle aus Bindegewebe umgeben, die entfernt werden muss, um die einzelnen Neuronen freizulegen. Verwenden Sie feine Pinzette, Iris-Schere und äußerste Vorsicht, um diese Hülle zu entfernen.

Um Neurone nicht zu beschädigen, stabilisieren Sie das entmantelte Ganglion mit etwa 15 Minuten langen Stiften, da jegliche Bewegung während der Bildgebung problematisch sein wird. Um scharfe Elektroden für die intrazelluläre Ableitung und Farbstoffinjektion vorzubereiten, ziehen Sie Kapillarrohre mit einem Mikroelektrodenzieher. Wir verwenden dünne, mit Filament versehene Borosilikatglaskapillaren mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter.

Die Ableitelektroden sollten einen Widerstand von etwa 10 Megaohm aufweisen, wenn sie mit dreimolarer Kaliumacetatlösung gefüllt sind, daher stellen wir den Puller entsprechend ein, um die D-Elektroden zu füllen. Tauchen Sie das hintere Ende der gezogenen Elektrode in eine 10-Millimolar-Lösung des Calcium-Orange-Farbstoffs; durch Kapillarwirkung wird der Farbstoff entlang des Glasfadens im Inneren der Elektrode in die Spitze gezogen. Danach füllen Sie die Elektrode mit 200 Millimolar Kaliumchlorid auf, um einen guten elektrischen Kontakt sicherzustellen. Wir verwenden ein selbstgebauten Bela, um die Elektrodeneigenschaften zu verbessern und den Widerstand der Ableitelektrode auf etwa fünf Megaohm zu senken.

Die Elektrode wird in einem Winkel von 45 Grad in einen Strom einer Aluminiumoxid-Suspension gehalten. Durch Zugabe von Natriumchlorid in die Suspension und Anschließen eines Ohmmeters kann der Elektrodenwiderstand überwacht werden. Während des Abschrägens überführen wir die Schale mit den deprimierten Buckelganglien auf eine Elektrophysiologie-Apparatur und lokalisieren die interessierenden Neuronen, indem wir sie mit Elektroden spicken und ihre Identität verifizieren.

Um Neuronen für die Kalzium-Bildgebung vorzubereiten, führen wir zunächst eine mit Farbstoff gefüllte Elektrode in das Zellkörper ein und laden den Farbstoff elektrophoretisch mittels 30 Minuten dauernder hyperpolarisierender Stromimpulse mit 15 Nanoampere. Während der D-Calcium-Orange-Farbstoff in die Zelle eindringt, nimmt das SOR eine schwache rosa Färbung an. Anschließend ziehen wir die Ableitelektroden vorsichtig zurück und lassen das Präparat mindestens 30 Minuten ruhen, damit sich der Farbstoff in den feinen Ausläufern des Neurons ausbreiten kann.

Als Nächstes überführen Sie die Schale mit der Präparation auf ein Fluoreszenzmikroskop. Wir verwenden ein 10-fach-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,3 mit Wassereintauchung an einem aufrechten Mikroskop mit feststehendem Objekttisch, bei dem die Fokussierung durch Bewegen des Objektivs und nicht des Tisches erfolgt. Dies erleichtert die Montage von Manipulatoren.

Wählen Sie für die Aufnahmeelektroden einen geeigneten Filterblock aus. Ein SI-Drei-Filterblock liefert die richtigen Anregungs- und Emissionsfilter für Calcium Orange. Stellen Sie die Kameraparameter sowie die Beleuchtungsintensität mit Neutraldichtefiltern und der Feldblende ein. Mehr Licht führt zu weniger Rauschen, kann aber möglicherweise die Probe ausbleichen.

Die schnelle CCD-Kamera mit Kühlung kann ein Bildfeld von 500 mal 300 Pixeln mit einer Bildrate von etwa 30 Bildern pro Sekunde und einem guten Signal-Rausch-Verhältnis erfassen. Minimieren Sie die Beleuchtung der Fil-Neuronen, indem Sie den Verschluss der Lichtquellen so oft wie möglich geschlossen halten. Wählen Sie im Bildgebungssoftware Bereiche von Interesse oder R ois aus.

Diese Bereiche definieren die Stellen, an denen die Software Intensitätsmessungen durchführt. Üblicherweise bilden wir die primären, sekundären und tertiären Verzweigungen des präsynaptischen Neurons ab. Platzieren Sie ein zusätzliches ROI neben dem difi-Neuron, um einen Hintergrundwert zu erhalten, der anschließend von allen anderen Datenpunkten subtrahiert wird.

Intrazelluläre Aufnahmeelektroden in prä- und postsynaptischen Neuronen werden verwendet, um die synaptische Übertragung auszulösen und zu überwachen. Sie können die Synchronisation zwischen elektrophysiologischer und bildgebender Datenaufnahme sicherstellen, indem Sie das Frame-Out-Auslössignal der Kamera verwenden, um die Datenaufnahmesoftware zu starten. Eine andere Möglichkeit zur Sicherstellung der Synchronisation besteht darin, eine LED im Kameraport anzubringen.

Diese LED wird kurz zu Beginn der Aufnahmesitzung eingeschaltet und liefert so eine Synchronisationsmarkierung. Während eines typischen Experiments lösen Sie Aktionspotentiale im präsynaptischen Neuron durch Injektion kurzer Strompulse aus. In diesem Beispiel zeigen wir einen Spikeschub und die entsprechenden Anstiege des Kalziumsignals, um spezifische Hypothesen zu überprüfen.

Das Kalziumsignal kann manipuliert und die Auswirkungen auf die synaptische Übertragung bestimmt werden. Beispielsweise können Wirkstoffe wie der Kalziumchelator EGTA präsynaptisch injiziert oder über das Perfusionsystem appliziert werden. Die Daten werden analysiert, indem sie aus der Bildgebungssoftware in eine Textdatei und anschließend in die Software exportiert werden, mit der die elektrophysiologischen Daten aufgezeichnet wurden, im vorliegenden Fall spike two von Cambridge Electronic Design.

Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Skript, um die Intensitätswerte der ROI und die entsprechenden Änderungen im Membranpotenzial darzustellen, und quantifizieren die Änderungen im Kalziumsignal, indem wir das Hintergrundsignal, das von der Hintergrund-ROI stammt, subtrahieren und die relative Änderung anhand der dargestellten Gleichung berechnen. F null ist die Fluoreszenz unmittelbar vor der Stimulation, und F ist die Fluoreszenz während der Stimulation. Hier zeigen wir die Ergebnisse eines Experiments, bei dem wir Änderungen der Kalziumfluoreszenz in dem identifizierten Neuron B 21 abgebildet haben.

Der Bereich, den wir abgebildet haben, ist in A dargestellt. In B induzierten wir einen Spikeschub in B 21, der postsynaptische Potentiale in B 8 und eine Änderung des Kalziumsignals hervorrief. B 2 zeigt die Wirkung der Injektion des Kalziumchelators. EGTA-Spikes in B 21 rufen keine weitverbreiteten Zunahmen der Kalziumfluoreszenz mehr hervor, und die Amplitude des postsynaptischen Potentials ist vermindert.

Zusammenfassend haben wir Techniken vorgestellt, die gleichzeitig die intrazelluläre Kalziumkonzentration überwachen und die Wirksamkeit der synaptischen Übertragung bewerten können. Diese Techniken erfordern im Vergleich zu den meisten funktionellen Bildgebungsverfahren nur bescheidene Ausrüstung und sind einfach und schnell zu erlernen.