Nachweis seltener Varianten von Genomic Pooled-Sequenzierung mit SPLINTER

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Gene innerhalb einer Population von Individuen zu identifizieren, die ein Übermaß an seltenen funktionellen Variationen aufweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Population von DNA-Proben gepoolt wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Next-Generation-Sequenzierungs-Bibliothek herzustellen und zu sequenzieren.

Darauf folgt die Ausrichtung der Reads an der Referenzsequenz und die Erstellung eines Fehlermodells. Der letzte Schritt ist die rechnergestützte Analyse mithilfe des Splinter-Algorithmus. Letztendlich wird die Splinter-Analyse von gepooltem Next-Generation-Sequencing verwendet, um Gene innerhalb von Populationen aufzuzeigen, die einen Überschuss an seltenen funktionellen Varianten aufweisen, und damit das Verfahren zu demonstrieren.

Heute wird Francesco Vilania dabei sein, ein Doktorand in dem Labor meines Mentors und Kooperationspartners Rob Mitra, der gemeinsam mit Enrique Ramos, einem Doktoranden in meinem Labor, arbeiten wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Genotypisierung einzelner Individuen liegt darin, dass sie eine sehr präzise Detektion seltener Sequenzvarianten in einer gemischten Population von DNA-Molekülen ermöglicht, ohne dass vorherige Informationen erforderlich sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Genetik und Genomik zu beantworten, beispielsweise wie die Häufigkeit neuartiger, krankheitsverursachender seltener Varianten in großen Kohortenstudien bestimmt werden kann.

Jedes Splinter-Experiment erfordert die Verwendung eines negativen und eines positiven Kontrollansatzes, um eine optimale Genauigkeit zu erzielen. Bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung unter Verwendung von PFU ultra high fidelity DNA-Polymerase vor. Die negative Kontrolle ist ein PCR-Produkt einer beliebigen DNA-Sequenz, von der bekannt ist, dass sie keine genetische Variation aufweist, beispielsweise ein klonierter Vektor-Backbone.

Hier wird ein 1.934 Basenpaare langes Amplikon aus dem M13MP18-Vektor verwendet. Die positive Kontrolle kann aus einem beliebigen Satz zuvor validierter Sequenzvarianten bestehen, die in der gesamten Population vorhanden sind. Falls diese Daten nicht verfügbar sind, hat dieses Labor eine künstliche positive Kontrolle entwickelt, die aus einem 331 Basenpaare langen PCR-Produkt aus einer Mischung von konstruierten Sequenzen besteht, die in den pGEM-T-easy-Vektor kloniert wurden, wie in dieser Tabelle aufgeführt.

Diese Sequenzen werden kombiniert, um verschiedene Frequenzen von Minor-Allelen echter Varianten innerhalb des Patientenkollektivs nachzuahmen. Nach der PCR-Amplifikation der Proben, wie im schriftlichen Protokoll zu diesem Video beschrieben, reinigen Sie jedes PCR-Produkt von überschüssigen Primern mithilfe der Kyogen-Kayak-Schnellsäulenchromatographie oder von 96-Loch-Filtrationsplatten mit Vakuummanifold für großtechnische Reinigung. Quantifizieren Sie anschließend jedes gereinigte PCR-Produkt mit Standardmethoden.

Bereiten Sie die Kombination aller PCR-Produkte und Kontrollen zu einem Pool vor, der nach Molekülzahl normalisiert ist. Die Poolbildung nach Konzentration führt zu einer Überrepräsentation kleiner Amplikone gegenüber größeren Produkten. Stattdessen sollten eine normalisierte Anzahl von Molekülen pro Amplikon gepoolt werden.

Wählen Sie beliebige Zahlen, die groß genug sind, um die Genauigkeit während des Pipettierens zu gewährleisten. Ziehen Sie die PCR-Produkte und Kontrollen ab. Eine Ligierung der PCR-Produkte ist notwendig, da die Fragmentierung kleiner PCR-Amplicons wahrscheinlich zu einer Verzerrung der Darstellung zugunsten ihrer Enden führt.

Aus diesem Grund ligieren wir die amplifizierten PCR-Produkte vor deren Fragmentierung in ein großes Konstrukt. Bereiten Sie eine Mischung für die stumpfendige Ligation unter Verwendung von T4-Ligase, T4-PNK und PEG gemäß dem Protokoll vor. Inkubieren Sie die Reaktion bei 22 Grad Celsius für 17 Stunden.

Anschließend 20 Minuten bei 65 Grad Celsius inkubieren und danach bei vier Grad Celsius lagern. Danach die Ligierung überprüfen, indem 50 Nanogramm der Probe in ein Agarosegel aufgetragen werden. Bei erfolgreicher Ligierung zeigt sich ein Band mit hohem Molekulargewicht in der entsprechenden Spur.

Bereiten Sie die DNA-Fragmentierung mittels einer zufälligen Sonifikationsstrategie vor, indem Sie die Probe 1:10 im Qiagen PB-Puffer verdünnen, um sie weniger viskos zu machen. Anschließend werden die großen Konen der PCR-Produkte mit einem 24-Proben-Diagonalknoten-Bioruptor fragmentiert, indem 25 Minuten lang bei hoher Leistung sonifiziert wird, mit jeweils 40 Sekunden Einschalt- und 20 Sekunden Ausschaltzeit pro Minute. Überprüfen Sie die Ergebnisse der DNA-Fragmentierung an einem Agarosegel und fahren Sie wie im Text beschrieben mit der Illumina-Sequenzierung fort.

Um die Sequenzierung zu beginnen, führen Sie die Read-Alignierung durch. Konvertieren Sie entweder die rohen Sequenzier-Read-Dateien in das SCARF-Format oder komprimieren Sie sie. Die Komprimierung ist optional.

Es spart Zeit und Platz für die nachfolgenden Analyse-Schritte, ohne relevante Informationen zu verlieren. Richten Sie mithilfe des beigefügten Alignments-Tools die rohen Reads an der annotierten Referenzsequenz aus. Spezifisch für die gezielten Regionen gehören die PCR-Reaktionen sowie die positiven und negativen Kontrollen dazu.

Das Eingabeformat muss im SCARF-Format oder komprimiert vorliegen. Führen Sie anschließend das Datei-Tagging wie im Text beschrieben durch. Jeder Durchlauf erzeugt ein eindeutiges Profil von Sequenzierungsfehlern, das zur genauen Variantenerkennung charakterisiert wird, um Fehler für jeden Durchlauf zu modellieren.

Ein interner Kontrollstandard, von dem bekannt ist, dass er sequenzbedingte Variation aufweist, wird in jede Pool-Probenbibliothek aus der alignierten, markierten Datei einbezogen. Erstellen Sie mithilfe des enthaltenen Werkzeugs eine Fehlermodell-Datei mit der Referenzsequenz der Negativkontrolle; sämtliche Sequenzen der Negativkontrolle können verwendet werden, oder alternativ nur ein Teilsatz, sofern dieser durch seine 5'- und 3'-Enden spezifiziert ist. Eindeutige Reads und Pseudocounts sollten stets angewendet werden.

Das Tool erzeugt drei Dateien, die entsprechend des Parameters für den Ausgabedateinamen mit null, eins oder zwei enden. Diese Dateien entsprechen einem Fehlermodell nullter, erster und zweiter Ordnung für die Variantenidentifizierung mit Splinter. Für die Visualisierung des Fehlerprofilverlaufs sollte stets das Fehlermodell zweiter Ordnung verwendet werden.

Das Pearl-Skript, das zum Erstellen des Fehlermodell-Graphen verwendet wird, kann eingesetzt werden, um aus der Fehlermodell-Datei der nullten Ordnung ein PDF-Fehlerdiagramm zu erzeugen. Die Plot-Datei zeigt laufspezifische Fehlertrends auf und kann genutzt werden, um die maximale Anzahl an Read-Basen für die Analyse abzuleiten. Im folgenden Abschnitt wird gezeigt, wie splinter auf der alignierten Datei ausgeführt wird, um mithilfe des Fehlermodells seltene Sequenzvarianten zu detektieren.

Der erste Schritt der Analyse besteht darin, splinter auf die alignierte Datei unter Verwendung der Referenzsequenz und des Fehlermodells anzuwenden. Einzelne Basen der Reads können von der Analyse ausgeschlossen werden, wenn sie als fehlerhaft erkannt werden. Der P-Wert-Schwellenwert legt fest, wie streng die Variantenidentifizierung durchgeführt wird.

Ein minimaler Grenzwert von minus 1,301 ist ein guter Ausgangspunkt. Die Poolgrößenoption optimiert die Signal-Rausch-Diskriminierung des Algorithmus, indem potenzielle Varianzen mit geringeren Allelfrequenzen als der eines einzelnen Allels im tatsächlichen Pool ausgeschlossen werden. Die Poolgrößenoption sollte auf den nächsthöheren Wert gesetzt werden, der größer ist als die tatsächliche Anzahl der im Experiment analysierten Allele.

Varianzen, die bei niedrigeren Frequenzen auftreten, werden als Rauschen ignoriert. Nach der Eingabe aller Parameter und Dateinamen führen Sie splinter aus. Diese Datei gibt alle Treffer zurück, die statistisch signifikant über die Probe hinweg sind, zusammen mit einer Beschreibung der Position und des Variantentyps.

P-Wert pro DNA-Strangfrequenz der Variante und Gesamtüberdeckung pro DNA-Strang. Die Listenflasche wird von Splinter verwendet, um die Überdeckung über die Probe hinweg zu normalisieren. Das erste Feld gibt das gewünschte Amplikon an, während das zweite Feld die Position angibt, an der die Mutation vorliegt.

N zeigt an, dass der restliche Sequenzabschnitt keine Mutationen enthält. Bei einer Normalisierung ist die Analyse der positiven Kontrolle entscheidend, um die Empfindlichkeit und Spezifität eines bestimmten Durchlaufs zu maximieren. Dies ist wichtig, da der anfängliche Schwellenwert von minus 1,301 höchstwahrscheinlich nicht ausreicht, um alle falsch positiven Ergebnisse auszuschließen.

Jede Splinter-Analyse zeigt den tatsächlichen P-Wert für jede identifizierte Variante an, der nicht a priori vorhergesagt werden konnte. Die gesamte Analyse kann jedoch wiederholt werden, indem der am wenigsten strenge P-Wert verwendet wird, der in der anfänglichen Ausgabe für die bekannten positiven Basenpositionen angezeigt wird. Dies dient dazu, alle echten Positiven beizubehalten und gleichzeitig die meisten, wenn nicht alle, falschen Positiven auszuschließen, die typischerweise deutlich weniger signifikante P-Werte aufweisen als echte Positive.

Um diesen Prozess zu automatisieren, kann das Cutoff-Tester-Skript verwendet werden. Das Cutoff-Tester-Skript benötigt eine Splinter-Ausgabedatei und eine Liste positiver Kontrolltreffer in Form einer tabulatorgetrennten Datei, wie sie für die Normalisierung verwendet wird. Die resultierende Ausgabe ist eine Liste von Cutoffs, die schrittweise den optimalen Cutoff erreichen.

Die letzte Zeile stellt den optimalsten Schwellenwert für den Durchlauf dar und kann daher für die Datenanalyse verwendet werden. Das optimale Ergebnis besteht darin, eine Sensitivität und Spezifität von eins zu erreichen. Falls dies nicht erreicht wird, kann die Splinter-Analyse optimiert werden, indem die Anzahl der integrierten Sequenzierzyklen verändert wird.

Der endgültige Cutoff kann mithilfe des Cutoff-Cut-Skripts auf die Daten angewendet werden, das die Splinter-Ausgabedatei nach Treffern unterhalb des optimalen Cutoffs filtert. Bei diesem Schritt wird die endgültige Splinter-Ausgabedatei generiert, die Snips und Indels enthält, die in der Probe vorhanden sind. Beachten Sie, dass die Ausgabe für Insertionen leicht von der für Substitutionen oder Deletionen abweicht.

Die Genauigkeit in Abhängigkeit von der Abdeckung für ein einzelnes Allel in einer gepoolten Probe wird in dieser Art von Diagramm veranschaulicht. Die Genauigkeit wird als Fläche unter der Kurve (abgekürzt AUC) einer Receiver-Operator-Charakteristik geschätzt und reicht von einer zufälligen Genauigkeit von 0,5 bis zu einer perfekten Genauigkeit von 1,0. In diesem Beispiel wird die AUC als Funktion der Abdeckung pro Allel für den Nachweis einzelner mutierter Allele in Pools von 200 bis 501.000 Allelen dargestellt.

Hier wird eine UC als Funktion der Gesamtanzahl für Insertionen, Deletionen und Substitutionen dargestellt. Dieses Fehlerdiagramm zeigt die Wahrscheinlichkeit, an einer gegebenen Position eine falsche Base einzubauen. Das Fehlerprofil weist niedrige Fehlerraten auf, die in Richtung des 3'-Endes des Sequenzierungsreads ansteigen.

Auffällig unterschiedliche Referenznukleotide weisen unterschiedliche Fehlerwahrscheinlichkeiten auf. Diese Darstellung zeigt die Genauigkeit von Splinter bei der Schätzung der Allelfrequenz für Positionen mit einer Abdeckung von mehr als 25-fach pro Allel. Ein Vergleich zwischen aus gepoolter DNA geschätzten Allelfrequenzen mittels Splinter und durch genomweite Assoziationsstudien oder GWAS-Ergebnisse gemessenen Allelhäufigkeiten.

Bei einer sehr hohen Korrelation wurde eine Population von 974 Individuen gezogen und gezielt über 20 Kilobasen zur Sequenzierung untersucht. Splinter wurde zur Detektion seltener Varianten angewendet. Gemäß dem Standardprotokoll war bei jedem Individuum zuvor eine Genotypisierung mittels GWAS durchgeführt worden, um die Übereinstimmung zwischen der Genotypisierung markierter und neuartiger Varianten zu überprüfen.

Die in der gepoolten Probe identifizierten Varianten waren ausgezeichnet. Drei Varianten, von denen zwei in der Bevölkerung selten waren, wurden als de-novo-Varianten aus den Sequenzierergebnissen identifiziert und durch individuelle Pyrosequenzierung validiert; die Frequenzen der seltenen Allele oder die Übereinstimmung zwischen Pyrosequenzierung und gepoolter Sequenzierung waren hervorragend. Nachdem Sie Ihre seltenen Varianten in der gepoolten Probe gefunden haben, möchten viele wissen, welche funktionellen Auswirkungen die identifizierten Varianten haben.

Daher wird die Annotation Ihrer Varianz zum nächsten Schritt im Prozess nach einer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der DNA-Sequenzierung den Weg, seltene Varianten auf schnelle und kostengünstige Weise zu untersuchen, um seltene Varianten in großen populationsbasierten Studien zu charakterisieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man seltene Sequenzvarianten in einer DNA-Probe mittels Splinter nachweist.