Solubilisierung und Bio-Konjugation von Quantenpunkten und bakterielle Toxizitätstests von Wachstumskurve und Keimzahl

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Hochdurchsatz-Screening der antibakteriellen Wirkungen von Nanopartikeln mit oder ohne Konjugation an Antibiotika durchzuführen. Hierzu werden die antibakteriellen Wirkungen von Poly-Mix und B, konjugierten Cadmiumtellurid-Quantenpunkten, untersucht. Die Quantenpunkte werden zunächst in Mercaptopropionsäure gelöst.

Anschließend werden die Quantenpunkte mit Poly-Mix und B konjugiert; antibiotikabehandelte Bakterien werden dann sowohl mit konjugierten als auch unkonjugierten Quantenpunkten behandelt, und die Hälfte der Proben wird 30 Minuten lang einer Bestrahlung mit blauem Licht von 440 Nanometer unterzogen, wodurch die Quantenpunkte Exzitonen und reaktive Sauerstoffspezies erzeugen, um den Effekt der Quantenpunkt-Behandlung auf das bakterielle Wachstum und die Überlebensfähigkeit zu bewerten. Es werden Messungen der optischen Dichte vorgenommen und Koloniezahlen bestimmt. Die resultierenden Daten zeigen, dass die Anwendung von antibiotikakonjugierten Cadmium-Tellurid-Quantenpunkten, gefolgt von Bestrahlung, die stärksten abtötenden Effekte unter allen getesteten Bedingungen hervorruft.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Wirkung von Cadmiumtellurid-Quantenpunkten und deren Konjugation an Polyx auf das Wachstum von E. coli ermöglicht, kann sie auch auf andere Arten von Nanopartikeln und Antibiotika bei verschiedenen Bakterienstämmen angewendet werden. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da ein Überschuss an MPA dazu führt, dass sich die Quantenpunkte aggregieren, und wenn sie auch nur eine geringe Menge an Toluol abpipettieren, zerstören sie den Filter.

Obwohl wir heute eine Methode zur Beurteilung der antibakteriellen Wirkung von antibiotisch konjugierten KE IDE-Quantenpunkten demonstrieren werden, könnte eine ähnliche Methode auch mit anderen Arten von Quantenpunkten wie Indiumphosphat, Zinksulfat sowie Cadmiumid-Zinksulfat verwendet werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Lösung aus Cadmiumtellurid- oder CdTe-Quantenpunkten in Toluol mit einer Konzentration von 15 µM in einem Glasfläschchen herstellen. Bestimmen Sie die optische Dichte (OD) mittels Absorptionsspektroskopie, indem Sie mit einer Pipette 200 µL dieser Stammlösung in ein Glasfläschchen überführen.

Nicht plastik verwenden. Dann 800 µL Toluol, ein Milliliter 200 mM Boratpuffer und zwei µL 11,5 M MER-Mercaptopropionsäure oder MPA hinzufügen, das Gefäß verschließen und 30 bis 60 Sekunden kräftig schütteln. Nach dem Schütteln trennen sich die wässrige und die organische Phasen von selbst.

Die wässrige Phase nimmt die Farbe der Quantenpunkte an. Um die Tiling-Schicht zu vermeiden, entfernen Sie diese, danach die Phase der Quantenpunkte, und überführen Sie sie in ein sauberes Gefäß. Zur Reinigung der solubilisierten Quantenpunkte überführen Sie diese in einen 500-Mikroliter-Zentrifugenfilter.

Fügen Sie 100 Mikroliter 50 Millimolar Bore-Acht-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie 13 Minuten lang mit 3000 × g. Führen Sie diese Waschung nach der letzten Waschung viermal durch. Suspendieren Sie die gewaschenen Quantenpunkte in 500 Mikrolitern Bore-Puffer und lagern Sie bei vier Grad Celsius.

Sie sind eine bis zwei Wochen stabil. Um die Konzentration der Quantenpunkte abzuschätzen, messen Sie die Absorptions- und Emissionsspektren. Diese Abbildung zeigt CdTe-Quantenpunkte unter Bestrahlung mit einer UV-Lampe sowie Emissionsspektren vor und nach der Wasserlöslichmachung, wobei eine vernachlässigbare Änderung der optischen Eigenschaften durch den Ligandenaustausch sichtbar ist.

Dieser Teil des Protokolls ist anwendbar auf alle negativ geladenen, wässrigen, solarisierten Nanopartikel, einschließlich Moos, kommerzieller Quantenpunkte, Metallpartikel und weitere. In diesem Beispiel wird das Antibiotikum Polymyxin B oder PMB im molaren Verhältnis von 30 zu 1 an die Quantenpunkte konjugiert. PMB ist positiv geladen und bildet ohne Notwendigkeit einer Konjugierung selbstständig Strukturen aus. Reagenzien: PMB und Wasser lösen sich auf.

Bei 60 Mikromolar. Für eine 96-Well-Platte mit 0,3 Milliliter Bakterien pro Well in vierfacher Ausführung ist 0,5 Milliliter einer 200 Nanomolar-Konjugatlösung ausreichend, um dies in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf 100 Mikroliter einmolarer Quantenpunkte in 50 Millimolar Bortuffer vorzubereiten.

Fügen Sie als Nächstes 50 µL der 10 x oder 60 µmol/L PMB-Antibiotikauflösung in Wasser zur Konjugatprobe hinzu. Geben Sie 50 µL Wasser zur Kontrollprobe. Stellen Sie das Volumen auf 0,5 mL mit 50 mmol/L Ate-Puffer ein, schützen Sie die Probenröhrchen mit Aluminiumfolie vor Licht und setzen Sie sie eine Stunde lang auf einen Rotator.

Wenn eine Aggregation auftritt, wiederholen Sie die Konjugation mit niedrigeren Konzentrationen des Antibiotikums. Titrieren Sie die Konzentration schrittweise nach oben, bis die Partikel nicht mehr aggregieren, um die Konjugate zu waschen. Gießen Sie die Lösungen durch einen Filter mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 10.000, der für die meisten Antibiotika geeignet ist, jedoch nicht für Proteine oder Antikörper.

Schließlich schätzen Sie die Anzahl der Antibiotikamoleküle pro Quantum durch Absorptions- oder Fluoreszenzspektroskopie, Gelelektrophorese oder transformierende Infrarotspektroskopie ab. Diese Abbildung zeigt die typischen Absorptions- und Emissionsspektren der Quantenpunkte vor der Konjugation mit PMB sowie die Emission nach Zugabe von 160 molaren Äquivalenten an PMB.

Die Beziehung zwischen dem Verhältnis von PMB und der durch die Quadrate angezeigten Emissionsintensität der Quantenpunkte sowie der durch die Dreiecke angezeigten Peak-Wellenlängenposition wird hier dargestellt. Mit zunehmender PMB-Konzentration nimmt die Emissionsintensität der Quantenpunkte ab, was zu einer Verschiebung der Peak-Emissionswellenlänge führt. Der nächste Teil des Protokolls wird durchgeführt, um die halbe maximale hemmende Konzentration oder IC50 des Antibiotikums und der Quantentoxizität am Abend zwei Tage vor dem Konjugationsexperiment zu bestimmen.

Impfen Sie 10 Milliliter LB-Medium mit einer frischen Kolonie von e coli. Füllen Sie am nächsten Tag, eine bis zwei Stunden vor dem Experiment, jedes der Löcher einer klaren 96-Loch-Platte mit Wachstumsmedium. Die Assay-Platte sollte wie hier gezeigt angeordnet sein.

Die Proben sollten im Dreifachansatz ausgeplattet werden, ebenso die Antibiotikakonzentrationen. Diese sollten einen ausreichend breiten Bereich abdecken, um eine Konzentration einzuschließen, die das Bakterienwachstum kaum hemmt, sowie eine, die alle Bakterien abtötet. Auch die Vertiefungen, die Quantenpunkte in den Konzentrationen enthalten, die in den Konjugat-Experimenten verwendet werden sollen, sollten im Dreifachansatz angelegt werden. Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette werden die entsprechenden Vertiefungen mit ein bis 50 µL Bakterienkultur beimpft.

Die Konzentration hängt davon ab, wie schnell der jeweilige Stamm wächst, und muss entsprechend kalibriert werden. Um das Wachstum zu überwachen, stellen Sie die Platte auf einen Plattenreader und stellen diesen so ein, dass er alle 10 Minuten über einen Zeitraum von zwei Stunden bei 600 Nanometern misst. Sobald die Zellen alle einen OD-Wert von 0,1 bis 0,15 erreicht haben, nehmen Sie die Platte vom Plattenreader und beenden die Aufzeichnung.

Fügen Sie anschließend die PMB in Quantenpunkten den entsprechenden Vertiefungen hinzu und decken Sie die Hälfte der Platte dreifach mit Aluminiumfolie ab. Danach stellen Sie die Platte unter eine spezielle 440-Nanometer-Lampe, die aus 2,4-Milliwatt-LEDs besteht, und belichten sie 30 Minuten lang. Nach der Lichtexposition geben Sie die Platte in das Plattenlesegerät und erfassen die OD 600 alle 10 Minuten über einen Zeitraum von fünf bis zwölf Stunden, abhängig von der Wachstumsrate. Halten Sie die Temperatur nach Möglichkeit unter 32 Grad Celsius, um das Austrocknen der Kulturen mithilfe der Software zu vermeiden.

Tragen Sie die Wachstumskurven zu einem ausgewählten Zeitpunkt gegen die logarithmische Konzentration auf und ermitteln Sie die IC50 des Antibiotikums mithilfe der auf dem Bildschirm angezeigten Hill-Gleichung, wobei H der Hill-Koeffizient ist. Ymax ist der höchste Wachstumspunkt und Ymin ist ein Nullpunkt, der sich idealerweise ebenfalls auf einer Plateauphase befindet. Am Ende der Aufzeichnungszeit zeigen klare Brunnen eine vollständige Zelltodreaktion an, und entlang steigender Wirkstoffkonzentrationen sollte ein Gradient der Zelldichte sichtbar werden.

Die Bakterien sollten Wachstumskurven mit S-Form wie hier gezeigt aufweisen. Die Lage des maximalen Plateaus variiert stark zwischen Stämmen und hängt außerdem von der Temperatur ab. Ein bestimmter Zeitpunkt kann als repräsentativ gewählt werden, und die Werte können gegen den Logarithmus des Antibiotikums aufgetragen werden, um die IC50 zu ermitteln und die Quantenpunkte zu bewerten.

Toxizität und Überleben in Abhängigkeit vom Logarithmus der Quantenpunkt-Konzentration können ebenfalls aufgetragen werden, allerdings ist es selten, mit Quantenpunkten allein bei den verwendeten Konzentrationen eine signifikante bakterielle Abtötung zu erzielen. Sobald die Toxizität der Quantenpunkte und Antibiotika allein bestimmt wurde, kann derselbe Protokollansatz zur Bestimmung der Toxizität des Antibiotikums angewendet werden. Konjugierte Quantenpunkte dargestellt.

Hier ist ein Beispiel-Layout für den Assay. Beachten Sie, dass die Konjugate in steigenden Konzentrationen in vierfacher Ausführung getestet werden; ein Streifen mit Bakterienkontrolle, ein Streifen mit Wirkstoff allein sowie Probenlöcher nur für Quantenpunkte sollten ebenfalls enthalten sein. Die OD-600-Lesungen können anschließend zur Erstellung von Wachstumskurven verwendet werden, und die IC50-Werte können wie zuvor bestimmt werden.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für Konjugate, die genauso toxisch sind wie das Antibiotikum allein, sowie ein Beispiel für Konjugate, die toxischer sind. Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten oder CFU für jede Bedingung zu bestimmen, wählen Sie ein oder mehrere Vertiefungen der behandelten 96-Loch-Platte aus, die zur Durchführung von Plattenzählungen verwendet werden sollen. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung jedes ausgewählten Bakterienproben mit Kochsalzlösung zu.

Pipettieren Sie hierfür 180 Mikroliter Kochsalzlösung in die entsprechenden Reihen. Übertragen Sie 20 Mikroliter der Bakterienlösung und verdünnen Sie diese mit 180 Mikroliter Kochsalzlösung. Wechseln Sie die Pipettenspitze, mischen Sie und übertragen Sie 20 Mikroliter der verdünnten Bakterienlösung zu 180 Mikroliter Kochsalzlösung.

Wiederholen Sie diesen Vorgang sechs Mal. Nehmen Sie danach jeweils 10 µL aus den letzten sechs Verdünnungen und pipettieren Sie sie als Tropfen auf eine rechteckige Agarplatte. Auf einer rechteckigen Platte können 36 Tropfen angebracht werden.

Lassen Sie die Platte nach 15 Minuten Trocknungszeit bei Raumtemperatur 15 Minuten trocknen, anschließend inkubieren Sie die Platte 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie die Kolonien, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu bestimmen. Multiplizieren Sie die Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dividieren Sie durch das ausplattierte Volumen, um den Einfluss der Behandlungen auf das bakterielle Wachstum zu ermitteln.

Die Zelldichte von E. coli wurde bei OD 600 gemessen. Dargestellt sind repräsentative bakterielle Wachstumskurven mit verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen von null bis zum vollständigen Zelltod. Die offenen Symbole zeigen ausschließlich PMB mit den angegebenen Konzentrationen.

Die vollständig ausgefüllten Symbole stellen C-D-T-E-P-M-B ohne Bestrahlung dar, die halb ausgefüllten Symbole stellen C-D-T-E-P-M-B mit Bestrahlung dar. Die Bestrahlung hatte keinen Einfluss auf die ausschließlich PMB enthaltenden Proben, daher wurden diese Kurven der Übersichtlichkeit halber weggelassen. Dargestellt sind hier die Wachstumskurvenwerte nach 200 Minuten in Abhängigkeit vom log PMB sowie angepasste Kurven gemäß dieser Gleichung, um die IC50-Werte zu ermitteln und so den Einfluss des Lichts zu kontrollieren.

Es wird eine Kurve mit Antibiotikum allein und einer Lichtexposition von 30 Minuten erstellt. Diese Abbildung zeigt das bakterielle Überleben nach 200 Minuten in Abhängigkeit von der QD-Konzentration unter Verwendung von CDTE-QDs. Es ist eine geringe Toxizität bei Lichtexposition zu erkennen, jedoch zu gering, um einen IC50-Wert bestimmen zu können.

Dies zeigt, dass die Toxizität von CDTE allein bei den in der Konjugationsversuch verwendeten Konzentrationen vernachlässigbar ist. Zum Vergleich der Effekte verschiedener Behandlungen auf das Zellwachstum wurden Wachstumskurvenwerte nach 200 Minuten aufgetragen und an die zuvor gezeigte Gleichung angepasst, wie hier dargestellt. C-D-T-E-P-M-B-Konjugate waren toxischer als PMB allein. Im Vergleich zeigen Goldnanopartikel-A-U-P-M-B-Konjugate keine erhöhte Toxizität gegenüber PMB allein, um den Effekt der Behandlungen auf das bakterielle Überleben zu bestimmen.

Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten wurde für E. coli bestimmt, die in einer 96-Well-Platte kultiviert wurden, die mit P-M-B-Q-D-P-M-B oder allein mit QD behandelt und mit oder ohne I-Bestrahlung für 30 Minuten exponiert wurde, gefolgt von einer Inkubation bei 32 Grad Celsius für vier Stunden. Von jeder Bakterienprobe wurden serielle Verdünnungen mit Kochsalzlösung hergestellt, und jeweils 10 Mikroliter der 100× bis 10⁷× Verdünnungen wurden auf Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37 Grad Celsius inkubiert, und die Kolonien wurden nach 16 Stunden gezählt.

In diesem Beispiel wurden die Bakterien in den Plattenkolonnen A bis C mit zunehmenden Konzentrationen von CDTE behandelt. Konjugate ohne Bestrahlung sowie die Kolonnen D bis F enthalten Bakterien, die mit zunehmenden Konzentrationen von Konjugaten behandelt wurden. Zusammen mit einer 30-minütigen Bestrahlung sind die Verdünnungen entlang der Reihen dargestellt.

Die Daten zeigen, dass die Konjugate bei Bestrahlung eine stärkere Hemmung des bakteriellen Wachstums aufweisen als die Konjugate ohne Bestrahlung. Vergessen Sie nicht, dass die Reagenzien äußerst toxisch sind und stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Laborkitteln und Schutzbrille eingehalten werden müssen, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Hochdurchsatz-Screening der antibakteriellen Wirkung von Nanopartikeln mit oder ohne Konjugation zu Antibiotika durchführt.