Steuern der Größe, Form und Stabilität der supramolekularen Polymeren in Wasser

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Größe, Form und Stabilität supramolekularer dynamischer Nanopartikel in Wasser zu kontrollieren. Dies wird durch die Gestaltung selbstassemblierender oder polymerisierender dichotischer Verstärker erreicht, deren molekulare Struktur für attraktive und abstoßende Wechselwirkungen ausgelegt ist. Dies führt zu einem frustrierten Wachstumsmechanismus, der die Bildung selbstassemblierter Nanopartikel in Wasser mit kontrollierter sphärischer Form ermöglicht.

Als zweiter Schritt wird die Salzkonzentration der wässrigen Lösung erhöht, wodurch die abstoßenden Wechselwirkungen, die in der molekularen Struktur des disco-Amphi verankert sind, geschwächt werden. Dies induziert einen kugel- zu stabförmigen Übergang. Temperaturabhängige zirkulare Dichroismus- (CD-)spektroskopische Untersuchungen werden durchgeführt, um die zugrundeliegenden Mechanismen dieses kugel- zu stabförmigen Übergangs aufzuklären. Zusätzlich wird eine Kombination analytischer Methoden wie kryogene Transmissions-Elektronenmikroskopie und Kernspinresonanz verwendet, um den Übergang von einem Aggregattyp zum anderen zu messen und zu visualisieren. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, dass der kugel- zu stabförmige Übergang in einer verstärkten Kooperativität der supramolekularen Polymerisation zum Ausdruck kommt.

Dies beruht auf einem Übergang von einem antikooperativen Prozess in Nanopartikeln begrenzter Größe zu einem vollständig kooperativen Keimbildungs- und Streckungsmechanismus, der in diesem Fall zu sehr großen supramolekularen Polymeren, dynamischen Nano-Stäbchen, führt. Der Hauptvorteil der Kombination spektroskopischer Methoden wie CD-Spektroskopie, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und NMR mit mikroskopischen Techniken wie Kryo-TEM liegt darin, dass Übergänge supramolekularer Polymere in Wasser gemessen und visualisiert werden können. Diese dynamischen Polymere können auf externe Reize wie Temperaturänderungen, Änderungen der Ionenstärke oder pH-Änderungen reagieren.

Die Kombination dieser Methoden ist breit anwendbar und kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen der molekularen Chemie und der selbstassemblierten Nanomaterialien zu beantworten. Beispielsweise kann der Zusammenhang zwischen den Abmessungen der Aggregate, die durch die Selbstorganisation kleiner molekularer Bausteine entstehen, und den zugrundeliegenden Bildungsmechanismen untersucht werden. Die Bedeutung dieser Methodik erstreckt sich auf eine Vielzahl von bio-nanotechnologischen Anwendungen.

Wir haben uns besonders für den Bereich der biomedizinischen Bildgebung und die Entwicklung selbstassemblierender nano-partikulärer Kontrastmittel interessiert, wobei ein empfindliches Gleichgewicht zwischen der Aggregatstabilität, hohem Kontrast und der Fähigkeit, die selbstassemblierten Kontrastmittel wieder auszuscheiden, für deren Erfolg im klinischen Einsatz von entscheidender Bedeutung ist. Unsere Idee, Charakterisierungstechniken zu kombinieren, entstand, als wir erkannten, dass subtile Änderungen in der Molekülstruktur der selbstassemblierenden Bausteine zu grundlegenden Unterschieden im Mechanismus der supramolekularen Polymerisation führen können. Den Ablauf des Verfahrens wird Paul Beaumont demonstrieren, der Experte und verantwortlich für die Cryo-10-Anlagen an der Technischen Universität Trovan.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Herstellung einer BTA-Gadolinium-DTPA-Lösung in 100 Millimolarer Citratpufferlösung, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Füllen Sie zusammen mit diesem Video eine UV-Q-Vet mit der Lösung. Setzen Sie die Vet in die Qve-Halterung am kreisförmigen D-Crowism-Spektrometer ein.

Messen Sie ein CD-Spektrum von 230 bis 350 Nanometern. Anschließend messen Sie eine CD-Abkühlkurve im Bereich der Bande mit der höchsten Intensität von 363 auf 283 Kelvin mit einer Abkühlrate von einem Kelvin pro Minute. Danach geben Sie das gleiche Volumen einer zwei Molaren Natriumchlorid-Pufferlösung zur Citrat-Pufferlösung von BTA-Gadolinium-DTPA hinzu.

Dadurch wird die Ionenstärke auf ein molares Natriumchlorid erhöht und die Discos auf die halbe Konzentration verdünnt. Vortexen Sie die Lösung mit erhöhter Ionenstärke 40 Sekunden lang nach der Erhöhung der Ionenstärke und nehmen Sie erneut ein CD-Spektrum von 230 bis 350 Nanometern auf. Anschließend messen Sie eine CD-Abkühlungskurve bei der CD-Bande mit der höchsten Intensität von 363 auf 283 Kelvin mit einer Geschwindigkeit von einem Kelvin pro Minute.

Exportieren Sie die rohen CD-Daten in Origin 8.5. Normalisieren Sie die Spektren, indem Sie den CD-Effekt bei der höchsten gemessenen Temperatur als gleich null und den CD-Effekt bei der niedrigsten gemessenen Temperatur als gleich eins definieren, da die Stärke des CD-Effekts proportional zum Grad der Aggregation ist. Die normalisierten CD-Kurven sind somit proportional zum Grad der Aggregation. Die normalisierten Daten werden mittels einer nichtlinearen Kurvenanpassung in Origin Pro 8.5 unter Verwendung eines temperaturabhängigen Selbstassemblierungsmodells angepasst.

In diesem Modell werden ein Keimbildungs- und ein Wachstumsregime unterschieden. Passen Sie zunächst den Grad der Aggregation im Wachstumsregime an. In dieser Gleichung steht T für die variable Temperatur.

PHI N ist die netto Helizität, die proportional zum Grad der Aggregation ist, und HE ist die molekulare Enthalpie der Verlängerung. T TE repräsentiert die Verlängerungstemperatur, also die Temperatur, bei der die Selbstorganisation thermodynamisch günstig zu werden beginnt. Der Normierungsfaktor fiat wird eingeführt, um sicherzustellen, dass Phi N durch fiat nicht größer als eins wird, was sich aus der Beschränkung ergibt, dass der Grad der Aggregation nicht überschritten werden kann.

Die Unity-Anpassung ermöglicht die Ermittlung der Elongationsenthalpie in Joule pro Mol und der Elongationstemperatur in Kelvin, die die Selbstassemblierung der Moleküle für eine gegebene Konzentration charakterisieren. Bei der Anpassung ist die Einschränkung zu beachten, dass nur der Grad der Aggregation bei Temperaturen unterhalb TE angepasst werden sollte, da die Gleichung nur im Elongationsregime gültig ist. Nach der Anpassung der ersten Gleichung ist der einzige unbekannte Parameter in der Gleichung für das Keimbildungsregime die Aktivierungskonstante ka, die die Kooperativität der supramolekularen Polymerisation beschreibt. Um die Aktivierungskonstante zu bestimmen, wird der experimentell ermittelte Grad der Aggregation für Temperaturen oberhalb TE im Keimbildungsregime angepasst.

Beginnen Sie mit der Herstellung der Lösungen für die Elektronenmikroskopie, wie im Text beschrieben. Bereiten Sie kurzfristig zwei Pufferlösungen vor: einen 100 Millimolar-Zitratpuffer und einen 100 Millimolar-Zitratpuffer mit fünf Mol Natriumchlorid. Lösen Sie BTA-Gadolinium-DTPA in jeweils 0,1 Milliliter der hergestellten Puffer, um eine Endkonzentration von einem Millimolar zu erreichen. Behandeln Sie anschließend ein Quantifoil-Kupfergitter mit Kohlenstoffbeschichtung mittels Plasma in einem C Resington 2 0 8 Carbon Coer, der bei fünf Milliampere für 40 Sekunden betrieben wird.

Das Vitrifizierungsverfahren ist ein entscheidender Schritt der Kryobereitung, da es sicherstellt, dass eine dünne Schicht des glänzenden ISIS, das dabei entsteht, für die TAM-Analyse geeignet ist. Die wässrige Lösung wird während der Vitrifizierung auf einem automatisierten FEI Vitro Bot auf das Raster aufgetragen. Dies beinhaltet das Aufbringen der Probe auf das Raster, das Abtupfen überschüssiger Flüssigkeit, um einen dünnen Film der wässrigen Lösung auf dem Raster zu erzeugen, und anschließend die Vitrifizierung durch schnelles Eintauchen des Rasters in flüssiges Ethan.

Nach der Vitrifizierung das behandelte Raster in flüssigen Stickstoff überführen, um es zu konservieren, anschließend das Probenraster manuell in eine Autoladerkassette überführen, die ebenfalls mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird. Der nächste Schritt besteht darin, die Kassette in die TUE Cryo Titan, TEM Auto Loader, einzuführen. Die TUE Cryo Titan ist mit einer Feldemissionskanone ausgestattet, die bei 300 Kilovolt arbeitet.

Die Aufnahme der TAM-Bilder erfordert Erfahrung und schnelles Vorgehen, da der hochenergetische Elektronenstrahl die Probe während der Bildaufnahme beschädigt. Nehmen Sie die Bilder mit einer CCD-Kamera auf, die mit einem nachgeschalteten Gatin-Energiefilter ausgestattet ist. Da Gadolinium stark paramagnetisch ist und die Protonensignale dadurch erheblich verbreitert würden, wurde eine andere Disko verwendet, bei der Gadolinium durch diamagnetisches Yttrium und eine Lösung von BT-Yttrium ersetzt wurde.

DTPA wird hergestellt. Berechnen Sie, wie viele Milligramm BT-Atrium-DTPA mit einer molaren Masse von 2.979 Gramm pro Mol notwendig sind, um eine Zielkonzentration von einem Millimolar zu erreichen. Lösen Sie danach die berechnete Menge an BT-Atrium-DTPA in 50 Millimolar Deuterat-Succinatpuffer in D₂O auf, nachdem 0,6 Milliliter der resultierenden Lösung in eine Wilma-LABAs-NMR-Röhre pipettiert wurden.

Platzieren Sie die Probe in einer Varianten-Einheit eines Nova-500-Spektrometers, das mit einer fünf Millimeter I-D-P-F-G-Sonde von Varian ausgestattet ist. Führen Sie die DOI-Experimente wie im Text beschrieben durch, nachdem Sie ein Standard-Protonen-NMR-Aufnahme aufgezeichnet, den 90-Grad-Impuls angepasst und die Mischzeiten entsprechend optimiert haben. Die DOI-One-Shot-Impulssequenz wird verwendet, nachdem die Eigendiffusion von HDO in der ovariellen Referenzprobe bestimmt wurde, und in der Probe wird der Diffusionskoeffizient der Aggregate ermittelt, aus dem der hydrodynamische Radius berechnet werden kann.

Berechnen Sie abschließend die hydrodynamischen Radien RH der Aggregate mithilfe der Stokes-Einstein-Beziehung für die Diffusion eines kugelförmigen Teilchens. Der ionische Charakter der peripheren Gadolinium-DTPA-Komplexe führt zu einer Frustration beim eindimensionalen Wachstum der Disco-Monomere, deren Kern so konzipiert ist, dass er zu langgestreckten, stabförmigen Aggregaten polymerisiert. Das Gleichgewicht zwischen anziehenden und abstoßenden Wechselwirkungen bestimmt die Größe und Form der Aggregate.

Eine leistungsstarke Technik zur Bestimmung der Größe und Form von Partikeln und Lösungen ist die Röntgen-Kleinwinkelstreuung an einer Synchrotronstrahlungsquelle. BTA-Gadolinium-DTPA wurde in einer Zitratpufferlösung gelöst, und die Streuprotokolle wurden bei zwei unterschiedlichen Konzentrationen aufgezeichnet.

Eine gegen null verlaufende Steigung im niedrigen Q-Bereich deutet auf einen Mangel an Form und Isotropie im Aggregat hin und legt die Anwesenheit kugelförmiger Objekte nahe. Die bei verschiedenen Konzentrationen gemessenen Daten wurden unter Verwendung eines homogenen, monodispersen kugelförmigen Formfaktors angepasst, was zu einem berechneten Radius von 3,2 Nanometern führte. Der berechnete geometrische Radius des monomeren Disco-BTA-Gadolinium-DTPA beträgt 3,0 Nanometer, was die Existenz von Aggregaten mit einem Aspektverhältnis nahe eins unterstützt und weitere Hinweise auf die kugelförmige Gestalt und nanometrische Größe der selbstassemblierten Objekte liefert.

Die protonendiffusionsgeordnete NMR-Spektroskopie wurde durchgeführt. Die DOSY-NMR ermöglicht die Bestimmung der Diffusionskoeffizienten der supramolekularen Aggregate, aus denen ihr hydrodynamischer Radius berechnet werden kann. Der Diffusionskoeffizient des aggregierten diamagnetischen Dichotikums in einem deuterierten Succinatpuffer wurde über die Stokes-Einstein-Beziehung zu 0,69 mal 10 hoch minus 10 Quadratmeter pro Sekunde bestimmt.

Ein hydrodynamischer Radius von 2,9 Nanometern wurde für die diskreten, sphärisch geformten Objekte berechnet. Diese Größe stimmt hervorragend mit dem aus SOX-Daten für BTA-Gadolinium-DTPA erhaltenen Wert überein. Weitere Hinweise auf eine erfolgreiche Kontrolle der eindimensionalen Stapellänge ergaben sich aus Kryo-TEM-Aufnahmen.

Das BTA-Gadolinium-DTPA bildet bei einer einmillimolaren Konzentration die erwarteten sphärischen Objekte mit Durchmessern nahe sechs Nanometern, was die Ergebnisse aus den So- und DOI-Messungen bestätigt. Die Bildung von stabförmigen supramolekularen Polymeren mit hohem Aspektverhältnis ist in Kryo-TEM-Aufnahmen bei hoher Ionenstärke eindeutig zu erkennen. Elektrostatische Abschirmung ist die wahrscheinlichste Erklärung für dieses Ergebnis.

Die Form verändert sich von einem kugelförmigen Aggregat mit einem Durchmesser von etwa sechs Nanometern hin zu langgestreckten Stäbchen mit einem Durchmesser von sechs Nanometern und einer Länge von bis zu mehreren hundert Nanometern. Die CD-Spektren von BTA-Gadolinium-DTPA bei Raumtemperatur in Abhängigkeit von steigender Salzkonzentration sind hier dargestellt. Die Konzentration von BTA-Gadolinium-DTPA beträgt bei niedriger Ionenstärke acht mal 10 hoch minus drei Millimolar und bei hoher Ionenstärke vier mal 10 hoch minus drei Millimolar.

Obwohl eine deutlich niedrigere Konzentration für die CD-Messungen verwendet wird, weist der klare Cotton-Effekt auf die Anwesenheit intakter Aggregate auch bei mikromolaren Konzentrationen hin. Die Form des CD-Spektrums ändert sich mit steigender Salzkonzentration, was ein guter Hinweis auf verminderte abstoßende Wechselwirkungen am Rand der Stapel und eine verbesserte Packung der Decos ist. Zusätzlich zeigen die CD-Abkühlkurven derselben Lösungen deutliche Unterschiede im Kurvenverlauf.

Die Temperatur, bei der die Aggregation beginnt, verschiebt sich bei höherer Salzkonzentration zu höheren Temperaturen. Ein zunehmend kooperativer Mechanismus wird ebenfalls deutlich, gekennzeichnet durch einen steileren Anstieg des CD-Effekts, während die Abkühlungskurve bei null molarem Natriumchlorid am besten durch ein ISO-schmisches Selbstorganisationsmodell beschrieben wird, das auf einen anti-kooperativen Prozess hinweist. Die Abkühlungskurve bei 1,0 molarem Natriumchlorid ist typisch für einen kooperativen Selbstorganisationsprozess und kann durch ein Keimbildungs- und Wachstumsmodell beschrieben werden, das die thermodynamischen Parameter der Selbstorganisation von BTA-Gadolinium-DTPA bei null und einem molaren Natriumchlorid quantifiziert.

Mit einem kooperativen Modell wird deutlich, wie sich ka, die dimensionslose Aktivierungskonstante, verringert. Niedrigere Werte für KA deuten auf einen höheren Grad an Kooperativität im Selbstassemblierungsprozess hin, was sich in der Bildung stark gestreckter supramolekularer Polymere äußert. Wie in der Kryo-TEM beobachtet, ist es bei der Anwendung der demonstrierten experimentellen Techniken wichtig, sich daran zu erinnern, dass nur eine Kombination experimenteller Methoden zu einer aussagekräftigen Gesamtbeschreibung der untersuchten dynamischen Nanomaterialien führt.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie breit anwendbar unser kombinierter experimenteller Ansatz ist und wie er dabei helfen kann, zentrale Fragen auf dem Gebiet der selbstassemblierenden Nanomaterialien und Superpoems zu beantworten.