Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, T-Lymphozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder IPS-Zellen zu erzeugen und zu charakterisieren. Die IPS-Zellen können anschließend in vitro in einem OP9-DL1-Kultursystem differenziert und dann in einem rag-defizienten Mausmodell in vivo ausgereift werden. Alternativ können die Zellen genetisch so modifiziert werden, dass sie den OT1-TCR überexprimieren, und anschließend adoptiv übertragen werden, um eine in vivo-Entwicklung zu ermöglichen.

Nach sechs Wochen in-vivo-Differenzierung können die Mäuse durch intraperitoneale Injektion mit sieben Tumorzellen des EEG herausgefordert werden, woraufhin die Antigen-spezifische Spezifität der aus IPS-Zellen stammenden T-Zellen evaluiert werden kann. Letztendlich können sich die IPS-Zellen sowohl in konventionelle als auch in antigenspezifische T-Zellen differenzieren, wobei letztere in der Lage sind, Tiere vor einer Tumorchallenge zu schützen. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur individualisierten Krebsimmuntherapie.

Das Verfahren ermöglicht die Erzeugung einer großen Anzahl tumorreaktiver T-Zellen aus einer minimalen Menge an Patientenblut oder Hautgewebe. Am Tag null übertragen Sie fünfmal 10 hoch vier IPS-Zellen auf eine 100 Millimeter Kulturschale, die eine konfluente OP9-DL1-Zellmonoschicht in 20 % FBS enthaltendem alpha-MEM-Medium enthält. Am Tag fünf belichten Sie die Zellen mit Trypsin, zentrifugieren die Zellen nach einer 30-minütigen Inkubation in einer frischen 100 Millimeter Kulturschale im 37-Grad-Inkubator und plattieren fünfmal 10 hoch fünf der schwimmenden Zellen in 20 % FBS enthaltendem alpha-MEM-Medium mit murinem FLT3-Ligand in einer neuen 100 Millimeter Schale, die eine Monoschicht aus OP9-DL1-Zellen enthält. Am Tag acht pipettieren Sie vorsichtig die locker angehefteten Zellen ab, zentrifugieren die Zellen und übertragen sie anschließend in eine einzelne Vertiefung einer sechswelligen Kulturplatte, die mit einer konfluenten OP9-DL1-Zellmonoschicht beschichtet ist. Inkubieren Sie die Zellen weitere zwei Wochen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am Tag 22.

Inkubieren Sie abgelöste IPS-Zellen in frischem Medium in einer neuen Kulturschale bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Entfernen Sie anschließend etwa die Hälfte der schwebenden Zellen und filtrieren Sie sie durch einen 70 µm Nylon-Filter, um Zellklumpen auszuschließen. Waschen Sie die resultierende Einzelzell-Suspension dreimal mit kaltem PBS. Nach dem dritten Waschschritt resuspendieren Sie die Zellen in PBS bei 1,5 × 10⁷ Zellen pro Milliliter und bewahren Sie die Zellen vor der intravenösen Injektion auf Eis.

Stellen Sie eine vier Wochen alte, rag-defiziente Maus unter eine Infrarotlampe, um die Schwanzvene zu weiten. Füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer Nadel der Stärke 26,5 versehen ist, mit 200 µL der Zellsuspension und übertragen Sie die Zellen adoptiv über die erweiterte Schwanzvene. Drei Wochen später, nachdem die Tötung der adoptiv übertragenen Maus bestätigt wurde, entfernen Sie die Lymphknoten und die Milz, nachdem die Gewebe mechanisch zerkleinert wurden.

Lysieren Sie die Einzelzell-Suspension mit einem CK-Lysepuffer und waschen Sie die resultierenden mononukleären Zellen anschließend zweimal in kaltem PBS. Nach der Färbung für Oberflächenmarker analysieren Sie die Zellen am Tag null mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie am Tag eins das Gen JAMA-Transfektionsreagenz, um die über Nacht angesiedelten PlatE-Verpackungszellen mit einem OT-eins-MIDR zu transfizieren. Säen Sie am Tag zwei eine mal 10 hoch sechs IPS-Zellen in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte mit 0,1 % Gelatine-Beschichtung aus. Sammeln Sie anschließend das Pseudovirus enthaltende S-natin aus den PlatE-Zellen und filtrieren Sie es durch einen 0,4-Mikron-Filter, um potenzielle Kontaminanten nach der Zentrifugation auszuschließen. Transduzieren Sie die Zellen in Anwesenheit von Polybrain für eine Stunde bei 330 × g bei 32 Grad Celsius.

Inkubieren Sie sie über Nacht bei derselben Temperatur, nachdem Sie den Transduktionsvorgang wiederholt haben. Behandeln Sie die transduzierten iPS-Zellen am vierten Tag mit Trypsin und suspendieren Sie die Zellen nach dem Pellettieren in frischem Medium. Anschießend säen Sie sie auf vorab kodierten, bestrahlten SNL 767-Feeders. Sobald die transduzierten Zellen Konfluenz erreicht haben, sortieren Sie die GFP- und DS-Red-doppelt positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie.

Sechs Wochen nach der adoptiven Übertragung der IPS-Zellen spritzen Sie am Tag 50 der Tumor-Challenge 50 Mikroliter EEG sieben Thoma-Zellen in die Peritonealhöhle derselben Maus. Verwenden Sie ein Mil E Biotech CD8-positive T-Zell-Isolationskit, um CD8-positive T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten des adoptiv übertragenen Tieres zu sortieren. Mischen Sie die isolierten CD8-positive T-Zellen mit bestrahlten SPOC-Zellen einer naiven C57BL/6J-Maus im Verhältnis 1:10 und stimulieren Sie die Ko-Kultur mit 0,5 Mikromol pro Milliliter OVA für 40 Stunden.

Anschließend Felsen A vier Stunden lang zu den Zellen geben. Schließlich die Zellpopulationen durch Durchflusszytometrie analysieren, nachdem SP-Zellen von einer naiven C57BL/6J-Maus isoliert wurden. Die Zellsuspension in zwei Gruppen aufteilen.

Markieren Sie die CFSE-hohe Gruppe mit fünf Mikromol pro Milliliter CFSE und stimulieren Sie die Zellen eine Stunde lang mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Ova-Peptid, kennzeichnen Sie die A-C-F-S-E-niedrige Gruppe mit 0,5 Mikromol pro Milliliter CFSE und stimulieren Sie nicht. Mischen Sie 2,5 × 10⁶ der CFSE-hohen Zellen mit 2,5 × 10⁶ der CFSE-niedrigen Zellen in PBS. Anschließend analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie auf die CFSE-Expression.

16 Stunden nach der adoptiven Übertragung in die Maus zur Zählung von intraperitonealen Tumorzellen am Tag 20 der Tumorchallenge. Spülen Sie die Bauchhöhle mit einer 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 18,5-Gauge-Nadel und kaltem PBS ausgestattet ist. Zählen Sie die gewonnenen Tumorzellen zur Identifizierung von Tumor-infiltrierenden Zellen.

Entfernen Sie den Tumor in einem späten Stadium der Tumorbehandlung und schneiden Sie den Tumor dann in drei Stücke. Geben Sie das erste Tumorstück in ein Kryoröhrchen und stellen Sie das Röhrchen auf Trockeneis. Fixieren Sie das zweite Stück unverzüglich mit Formaldehyd.

Bewahren Sie das dritte Stück in konditioniertem RPMI 1640-Medium auf, nachdem Sie die kryokonservierten Gewebeschnitte luftgetrocknet haben. Fixieren Sie sie nach dem erneuten 15-minütigen Lufttrocknen der fixierten Schnitte 15 Minuten lang in kaltem Aceton. Waschen Sie die Objektträger fünf Minuten lang in PBS nach der Wäsche.

Legen Sie die Objektträger in eine feuchte Kammer und bedecken Sie die Gewebeschnitte 30 Minuten lang mit 30 Mikrolitern 3 % B, SA und PBS, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Danach entfernen Sie die Blockierpufferlösung vorsichtig durch Abtupfen und inkubieren die Gewebeschnitte zwei Stunden lang in der feuchten Kammer mit einem 50-Mikroliter-Gemisch aus pe-anti-TCR-RV-alpha-2-Antikörper und fitzy-anti-Ova-Antikörper, verdünnt in 3 % PSA in PBS. Spülen Sie die Objektträger anschließend dreimal mit kaltem PBS, bringen Sie die Schnitte schließlich mit einem wasserbasierten Eindeckmedium auf und untersuchen Sie sie mikroskopisch mittels Fluoreszenzmikroskopie zur Durchflusszytometrie-Analyse von tumorinfiltrierenden T-Zellen.

Zerquetschen Sie den Tumor zu einer Einzelzell-Suspension. Anschließend analysieren Sie die Zellen auf spezifische Oberflächenmarker. CD drei und TCR beta werden als Marker für T-Zellen verwendet, um zu bestimmen, ob die Stimulierung von iPS-Zellen mit dem Notch-Liganden DL eins zur Expression von CD vier und CD acht auf der Zelloberfläche bei CD drei positiven, TCR beta positiven, aus iPS-Zellen abgeleiteten Zellen beitragen könnte.

Beachten Sie das Punktdiagramm rechts, das am Tag 22 CD3-positive, TCRβ-positive, CD4-negative, CD8-positive, einzelpositiven T-Zellen zeigt, die in vitro aus IPS-Zellen generiert wurden. Außerdem produzierten die aus IPS-Zellen stammenden einzelpositiven Zellen aus der vorherigen Abbildung Interleukin-2 und Interferon-γ, wenn sie in vitro durch plattenbeschichtete anti-CD3- und lösliche anti-CD28-Antikörper stimuliert wurden, was bestätigt, dass die aus IPS-Zellen stammenden T-Zellen nach adoptiver Übertragung in Empfängermäuse funktionsfähig sind. Der Großteil der mit TCR-Gen transduzierten IPS-Zellen differenzierte zu CD8-positiven CTLs, die in vitro auf Peptidstimulation reagierten, indem sie Interleukin-2 und Interferon-γ sekretierten, wie in diesen Punktdiagrammen aus gepoolten Lymphknoten- und Milzzellen zu sehen ist.

CD8-positive, Vβ5-positive T-Zellen wurden in Mäusen erzeugt, die adoptiv mit TCR-transduzierten, jedoch nicht mit Kontroll-transduzierten iPS-Zellen versorgt worden waren. Die CD8-positiven, Vβ5-positiven Populationen zeigten eine positive intrazelluläre Zytokinstaining für Interleukin-2 und Interferon-γ-Produktion, dargestellt in diesen Histogrammen durch die dunklen Linien im Vergleich zu den schattierten Isotypkontroll-Histogrammen, was darauf hinweist, dass die aus iPS-Zellen abgeleiteten CTLs funktionsfähig waren. Diese Daten zeigen CFSE-hohe Zellen, die mit Peptid pulsatiert wurden und durch die Peaks rechts in jedem Diagramm dargestellt sind, sowie CFSE-niedrige Kontrollzellen, die durch die Peaks links dargestellt sind und die 10 Wochen nach iPS-Zell-Transfer oder einen Tag nach OT-I-CTL-Transfer in Mäuse injiziert wurden.

Die antigenspezifischen aus IPS-Zellen abgeleiteten CTLs reagierten auf die Antigenstimulation und wiesen zytotoxische Aktivität auf, was durch das Fehlen von CFSE-hoch-Zellen hier angezeigt wird. OT-I-TCR-Gen-transduzierte IPS-Zellen wurden adoptiv in C57BL/6-Mäuse übertragen, und anschließend wurden die Mäuse am Tag 20 mit EEG7-Tumorzellen herausgefordert. Die Tumorzellen in der Bauchhöhle wurden gezählt. Beachten Sie die signifikante Verringerung der Tumorzellanzahl bei Mäusen, die TCR-transduzierte IPS-Zellen erhalten hatten, im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Am wichtigsten ist, dass die adoptive Übertragung von TCR-transduzierten iPS-Zellen eine Infiltration überreaktiver CTLs in Tumorgewebe auslöste und die Tiere vor einer Tumorchallenge schützte, wie in dieser H-und-E-Färbung von Tumorgeweben zu sehen ist, die 30 bis 35 Tage nach der Tumorchallenge gewonnen wurden – Tumore von Mäusen, die adoptiv mit TCR-transduzierten Zellen oder OT-I-CTLs übertragen wurden, jedoch nicht von mock-injizierten oder Kontrolltieren. Die transduzierten Zellen waren von entzündlichen Zellen infiltriert, wie durch die roten Pfeile hier angezeigt. Ova-spezifische Vα2-positive CTLs in rot wurden dabei beobachtet, wie sie in ova-exprimierendes Tumorgewebe in grün eindrangen.

Während Tumore von Mäusen der Kontrollgruppen in dieser Abbildung weniger oder keine tumorinfiltrierenden Zellen aufwiesen, wurden Einzelzell-Suspensionen aus Tumorgeweben nach Gating der CD8-positiven Population mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von V-alpha-2-Positivität und V-beta-5-Positivität analysiert. Beachten Sie, dass Tumorgewebe von Mäusen, die adoptiv mit TCR-transduzierten iPS-Zellen übertragen wurden, den höchsten Grad an tumorinfiltrierenden Zellen zeigten, während Tumore von Mäusen, die kontrolltransduzierte iPS-Zellen erhielten, keine Infiltration durch ova-spezifische CD8-positive T-Zellen aufwiesen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man antigen-spezifische T-Zellen aus IPS-Zellen erzeugt, und wie man die Funktionen der aus IPS-Zellen abgeleiteten T-Zellen bewertet.