Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Population gesunder Stammzellen neben einer Stammzell-ablatierten Geweberegion innerhalb eines Parian zu positionieren, um das Verhalten von Stammzellen und deren Tochterzellen während der Regeneration in vivo zu analysieren. Dazu wird entweder ein nicht bestrahlter oder ein Leafly bestrahlter Parian anästhesiert und fixiert, um weitere Manipulationen durchzuführen. Anschließend wird der fixierte, nicht bestrahlte Parian teilweise mit Blei abgeschirmt und anschließend mit Röntgenstrahlen bestrahlt. Dadurch entsteht ein unverletzter Parian, bei dem das Stammzell-ablatierte Gewebe direkt an das abgeschirmte, weiterhin Stammzellen enthaltende Gewebe angrenzt.

Alternativ kann ein Gewebetransplantat, das von einem nicht bestrahlten Spender stammt, in einen zuvor bestrahlten Wirt transplantiert werden, um ein Parium mit einer isolierten Population von Stammzellen zu erzeugen. Fally vorhandene Stammzellen innerhalb eines ansonsten durch Stammzellen ablatierten Wirts zeigen Ergebnisse, die isolierte Populationen von Stammzellen neben den durch Stammzellen ablatierten Geweben mittels RNA-In-situ-Hybridisierung am Gesamtpräparat für Stammzellmarkergene nachweisen.

Die hier beschriebenen Methoden zielen darauf ab, die Regeneration von Planarien besser zu verstehen, indem das Verhalten von Stammzellen sowohl im Transplantationsparadigma als auch im partiellen Bestrahlungsparadigma untersucht wird, was es uns ermöglicht zu testen, ob die umgebenden Gewebe und die lokalen Umgebungen, in denen sich diese Stammzellen befinden, das Verhalten dieser Neoblasten oder Stammzellen beeinflussen oder nicht. Ein bis zwei Monate vor dem Experiment füttern Sie die Plin gemäß dem begleitenden Manuskript. Um die gewünschte Größe in dieser Demonstration zu erreichen, werden Plin mit einer Länge von ein bis zwei Zentimetern und einer Breite von mehr als zwei Millimetern ausgewählt.

Dann werden sie drei bis sieben Tage vor der Verwendung gehungert. Als Nächstes bereiten Sie die Chlorothon-Lösung, ein mildes lokales Anästhetikum, zu, indem Sie 0,1 bis 0,2 % Gewicht pro Volumen Chlorothon in Paraffinwasser auflösen. Kühlen Sie die Lösung anschließend auf Eis. Für die Gewebetransplantation biegen Sie mit einem Bunsenbrenner ein Kapillarrohr mit einem inneren Durchmesser von 0,75 Millimeter ein bis zwei Zentimeter vom Ende zu einem Winkel von 90 Grad, um das Transplantatgewebe zu schneiden.

Biegen Sie dann eine weitere Kapillare mit einem Außen­durchmesser von 0,7 Millimeter ein bis zwei Zentimeter vom Ende her im 90-Grad-Winkel, um ein Loch im Wirt zu erzeugen, das die Transplantatprobe aufnehmen soll. Schneiden Sie anschließend das schwarze Filterpapier Watman sowie Filterpapier Kim-Wipe und Zigarettenpapier entsprechend den in der beigefügten Verschriftlichung angegebenen Größen zu.

Danach bereiten Sie die modifizierte Holt-Fers-Lösung und die gesättigte Caine-Holt-Fretter-Lösung vor. Kühlen Sie beide Lösungen auf vier Grad Celsius ab. Befestigen Sie dann ein gefaltetes Kim-Tuch an einem Stück Parafilm.

Platzieren Sie es auf der Peltier-Kühlplatte oder einem anderen Kühlsystem unter einem Stereomikroskop. Sättigen Sie danach das Kim-Tuch mit gekühlter Holt-Fretter-Lösung. Anschließend legen Sie zwei rechteckige schwarze Filterpapierstücke auf das Kim-Tuch.

Legen Sie nun ein Stück Watman-Filterpapier Nr. 2 in eine Petrischale. Befeuchten Sie das Filterpapier mit Holt-Fretter-Lösung. Kühlen Sie die Schale anschließend auf Eis für eine teilweise Bestrahlung.

Legen Sie einen größeren Papierliner in eine größere Schale, ähnlich wie bei einer Gewebetransplantation. Befeuchten Sie das Filterpapier mit Holt-Fretter-Lösung. Kühlen Sie die Schale anschließend auf Eis ab.

Befüllen Sie bei diesem Verfahren eine Petrischale mit gekühlter Cleone-Lösung. Pipettieren Sie die Planarien mithilfe der Pipette in die Schale zur Transplantation. Betäuben Sie jeweils nur einen Wirt und einen Spender gleichzeitig.

Bei der Teilbestrahlung können viele Tiere gleichzeitig anästhesiert werden. Anschließend lässt man die Paria fünf bis zehn Minuten lang in der Cleone-Lösung einweichen, bis sie bewegungslos werden. Die Paria werden durch Pipettieren in eine Schale mit gekühlter Holt-Fretter-Lösung gespült.

Danach fixieren Sie den Plin-Bereich, indem Sie ihn auf schwarze Filterpapiere pipettieren, die mit gekühlter Holt-Fretter-Lösung gesättigt sind. Orientieren Sie die Proben dann mit einer Pinzette der Bauchseite nach unten. Stellen Sie nun eine zuvor zubereitete gekühlte Petrischale in einen Eisbehälter, die in einen oberen Röntgenbestrahlungsapparat passt.

Ordnen Sie den anesthetisierten Plin-Bereich in einer Petrischale an, indem Sie die schwarzen Filterpapiere verschieben. Danach überführen Sie sie auf die obere Quelle des Röntgenbestrahlungsgeräts, und positionieren Sie den Eisbehälter so, dass der Abstand von der Kathodenröhre zum Paria minimiert wird. Dadurch wird die effektive Dosisleistung maximiert.

Danach die Bleischilde zwischen die Paria und die Kathodenröhre für die Röntgendosis platzieren. Wenn eine vollständige Stammzellenablation aus nicht abgeschirmten Bereichen gewünscht ist, 30 Gray oder mehr verabreichen. Unmittelbar nach der Röntgenstrahlung die Paria in gekühltes Paria-Wasser überführen.

Danach das Parian-Wasser auf Raumtemperatur erwärmen lassen und die Tiere sich von dem schwarzen Filterpapier lösen lassen. Das partielle Bestrahlungsverfahren ist nun abgeschlossen. Um dieses Verfahren unter dem Stereomikroskop zu beginnen, ordnen Sie den anästhesierten Wirt und den Spenderplin-Bereich auf separaten rechteckigen schwarzen Filtern auf dem Kim-Tuch an, das zuvor bereits auf der Peltier- oder Kühlplatte gekühlt wurde.

Verwenden Sie eine Kapillare mit einem inneren Durchmesser von 0,75 mm, um den Transplantat-Stopfen aus dem Spender herauszuschneiden. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um den Stopfen auf einen ungestörten Bereich des Wirts zu legen. Verwenden Sie anschließend eine Kapillare mit einem äußeren Durchmesser von 0,7 mm, um einen Stopfen aus dem Wirt zu entfernen.

Positionieren Sie das Transplantat anschließend in der Öffnung. Überführen Sie den transplantierten Wirt auf dem rechteckigen schwarzen Filterpapier in die zuvor vorbereitete Petrischale. Befeuchten Sie ein Stück Rollpapier mit Caine-gesättigter Holt-Fretter-Lösung.

Danach darauf auf dem transplantierten Wirt platzieren. Anschließend vier Stücke Filterpapier, die gesättigte Holter-Lösung umschließen, mit dieser tränken und falls der transplantierte Wirt danach untergetaucht wird, vier Bündel zugeschnittener Kim-Tücher, die gesättigte Holt-Fretter-Lösung umschließen, mit dieser tränken. Diese über die Filterpapiere legen.

Danach den Deckel schließen. Die Petrischale auf Eis stellen. Anschließend den Donor-Parian in das Parian-Wasser zur Erholung und Regeneration überführen.

Wenn alle Transplantationen abgeschlossen sind, stellen Sie die transplantierten Parian in einen 10 Grad Celsius warmen Inkubator und lassen Sie sie dort über Nacht. Am nächsten Morgen bringen Sie sie in eine mit Parian-Wasser gefüllte Petrischale. Lassen Sie das Parian selbstständig vom Filterpapier abfallen oder entfernen Sie es vorsichtig mit einer Pinzette und wechseln Sie das Parian-Wasser danach alle zwei bis drei Tage einmal.

Die Loch-Montage-In-situ-Hybridisierung in der bestrahlten, aber vollständig abgeschirmten Kontroll-Parien, die drei Tage nach der Bestrahlung fixiert wurde, zeigt eine Verteilung von Stammzellen, die nicht von der der Wildtyp-Parien zu unterscheiden ist. Andererseits scheinen bei der nur teilweise abgeschirmten Parien, bei der die anterioren und posterioren Bereiche ungeschützt blieben, die Stammzellen in den nicht abgeschirmten Regionen ablatiert zu sein. Hier sind die dorsalen und ventralen Ansichten einer erfolgreich transplantierten Parien dargestellt.

Drei Tage nach der Transplantation ist das Transplantat sowohl auf der dorsalen als auch auf der ventralen Oberfläche deutlich sichtbar und von charakteristischem unpigmentiertem Gewebe an der Grenzfläche zwischen Transplantat und Wirt umgeben. Bei einer erfolglosen Transplantation hingegen ist am Transplantationsort kein sichtbares Transplantatgewebe vorhanden. Die Ganzpräparat-In-situ-Hybridisierung zeigte die Anwesenheit von Stammzellen nur in oder um die Transplantatstelle, was auf eine erfolgreiche Transplantation hindeutet, sobald diese Technik beherrscht ist.

Transplantationen können jeweils in nur fünf Minuten durchgeführt werden. Bei Erfolgsraten von nahezu 90 bis 100 % und teilweiser Bestrahlung lässt sich die Prozedur stark hochskalieren, vorausgesetzt, die Feldgröße Ihres Bestrahlungsgeräts ist ausreichend groß.