Vorbereiten T Cell Growth Factor von Rat Splenozyten

Hallo, ich bin Christine Beaton. Ich bin wissenschaftliche Mitarbeiterin im Labor von George Chen am Department für Physiologie und Biophysik der University of California in Irvine. In den nächsten zwei Tagen werde ich Ihnen zeigen, wie man TCGF herstellt, was für T-Zell-Wachstumsfaktor steht.

Bei unserer alltäglichen Zellkultur, wenn wir keine genaue Kenntnis über die Zusammensetzung der Zytokine im Kulturmedium benötigen, verwenden wir einen T-Zell-Wachstumsfaktor, also ein Überstand aus der Milzzellenkultur von Louis-Ratten, der die erforderlichen Zytokine enthält, um die Vermehrung der T-Zellen zu unterstützen. Die Herstellung des TCGF erfolgt folgendermaßen: Nach dem Töten gesunder Louis-Ratten entnehmen wir ihre Milzen, stellen eine Einzelzell-Suspension her, entfernen die roten Blutkörperchen durch Lyse und stimulieren anschließend die mononukleären Zellen mit Concanavalin A, wodurch die T-Zellen zur Produktion aller notwendigen Wachstumszytokine angeregt werden. Um das TCGF zu erzeugen, müssen wir die Zellen aktivieren.

Die Methode, die wir anwenden, besteht darin, dass wir unserer Zellkultur Lectin Concanavalin A, abgekürzt als ConA, hinzufügen. Wenn wir ConA zu unserer Zellkultur hinzufügen, bindet es an den glykosylierten T-Zell-Rezeptorkomplex, und da es gleichzeitig an mehrere dieser Komplexe bindet, führt dies zu einem sogenannten Capping. Dadurch aggregieren die Rezeptoren, bilden einen Cluster aller Rezeptoren an der Zelloberfläche, und dies löst ein Aktivierungssignal in den T-Lymphozyten aus.

Nachdem die Zellen aktiviert wurden, beginnen sie zu proliferieren. Sie vergrößern sich also und fangen anschließend an, Zytokine zu sezernieren. Ursprünglich nahmen wir an, dass TCGF hauptsächlich Interleukin-2 war, doch inzwischen wissen wir, dass dies nicht wirklich zutrifft.

Es enthält außerdem Interferon Gamma, TNF Alpha und vermutlich auch Zytokine in sehr geringen Mengen, die gerade notwendig sind, um die Zellen nach 48 Stunden in Kultur am Leben zu erhalten. In der Kultur haben die Zellen alle Zytokine produziert, die wir benötigen. Daher werden wir die Zellen entfernen, und nachdem wir die Zellen entfernt haben und nur noch das Überstandmedium haben, befindet sich immer noch etwas freies Conal im Überstand. Das wird ein Problem darstellen, da wir unseren T-Zell-Wachstumsfaktor unbedingt dafür verwenden möchten, T-Zell-Linien weiterwachsen zu lassen.

Und wenn wir das Conval frei in der Lösung belassen, würde es die Zellen aktivieren, wenn wir das nicht wünschen. Um dieses Problem zu umgehen, fügen wir einen Überschuss an einem Zucker hinzu, der an das gesamte freie Conval im Medium bindet. Dadurch wird es vollständig inaktiviert und kann nicht an andere glykosylierte Rezeptoren auf den Zellen binden, wenn wir den TCGF der Kultur hinzufügen.

Beginnen wir. Der erste Schritt für dieses Experiment besteht darin, die Milz unmittelbar nach der Tötung aus einer Ratte zu entnehmen. Das werde ich nun mit sterilen Instrumenten durchführen.

Und sobald ich die Milzen entfernt habe, lege ich sie in PBS, das mit Antibiotika ergänzt ist, und zwar verwende ich Penicillin und Streptomycin. Beginnen wir also. Ich besprühe die Ratte mit 70 %igem Ethanol, um sicherzustellen, dass meine Kultur nicht durch Kontamination beeinträchtigt wird.

Und dann führe ich mit meinen Instrumenten einen kleinen Schnitt in die Haut hier durch. Anschließend entferne ich die Muskelschicht, und die Milz erscheint genau hier. Ich nehme also eine andere Pinzette und ziehe vorsichtig die Milz heraus, ohne sie zu beschädigen.

Ich entferne das Bindegewebe auf diese Weise. Jetzt habe ich eine Milz. Natürlich achte ich sehr darauf, nichts anderes in der Bauchhöhle zu beschädigen, da jede Verletzung des Darms sofortige Kontamination meiner Milz verursachen würde.

Dann überführe ich meine Milz in ein Reagenzglas, das PBS mit Antibiotika enthält. Dieses Reagenzglas halte ich auf Eis. Nun habe ich die Milzen von drei Ratten gewonnen.

Wir sind also bereit loszulegen und eine Einzelzell-Suspension aus diesen Milzen herzustellen. Nun, da ich meine Milzen habe, habe ich sie in eine Gewebekulturhaube gebracht, um daraus mithilfe von 70-Mikron-Zellseihen eine Einzelzell-Suspension vorzubereiten. Für die Herstellung der Einzelzell-Suspension aus den Milzen benötige ich nun mehrere Dinge.

Ich benötige sterile Instrumente, ein Paar Pinzetten und ein Paar Scheren. Dann habe ich den Kolben einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze in der Petrischale. Ich werde meine Milzen in PBS mit Antibiotika geben.

Und in einer anderen Petrischale habe ich einen 70-Mikron-Zellsieb in 10 Milliliter PBS mit Antibiotika gegeben. Der erste Schritt besteht also darin, sicherzustellen, dass die Milzen sauber sind, da, wie hier zu sehen ist, noch kleine Stücke von Bindegewebe vorhanden sind, die ich entfernen werde, da sie den Zellsieb sehr schnell verstopfen würden. Dazu schneide ich einfach das, was ich nicht benötige, ab und entsorge es in den Deckel der Petrischale.

Jetzt sind meine Milzen größtenteils sauber, daher nehme ich die Milzen nacheinander, lege sie in den Zelltrichter und schneide sie in kleine Stücke. Anschließend vermische ich alle drei Milzen. Der nächste Schritt besteht darin, eine Einzelzell-Suspension herzustellen. Natürlich, da ich alles steril halten möchte, berühre ich den Zelltrichter überhaupt nicht und verwende den Kolben einer sterilen 1-ml-Spritze, um die Milzstücke durch den Zelltrichter zu pressen.

Und wie Sie an der Außenseite des Zelltrichters sehen können, wird eine Einzelzell-Suspension hergestellt. Beim ersten Durchgang habe ich noch einige kleine Milzstücke, aber ich werde bereits die Einzelzell-Suspension abnehmen. Ich habe sie bereits in ein 50-ml-Röhrchen überführt, das ich auf Eis lagere.

Und ich werde meinen Zellfilter mit weiteren 10 ml PBS und Antibiotika auffüllen. Ich gebe also ungefähr weitere 10 ml meines PBS mit Antibiotika hinzu – es muss nicht exakt 10 ml sein, da wir lediglich spülen. Ich gebe es in den Zellfilter und wende dann das gleiche Verfahren erneut an.

Ich kehre zu meinem Spritzenkolben zurück und drücke etwas stärker durch das Sieb. Natürlich erhalten Sie niemals alles, da Bindegewebe und kleine Fettstücke, die ich nicht entfernen konnte, im Zellsieb verbleiben. Den Großteil Ihrer Milz sollten Sie jedoch im Zellsieb auffangen.

Dann wiederhole ich exakt das, was ich zuvor gemacht habe. Ich werde meine Einzelzell-Suspension ernten und sie derselben Zahnprobe hinzufügen. Inzwischen befindet sich fast nichts mehr vom Sieb im Zellseparierer, und das auströmende PBS ist deutlich klarer. Ich werde einfach noch einmal waschen, und bis dahin sollten sich die meisten Zellen bereits gelöst haben.

Jetzt habe ich meine Einzelzell-Suspension aus PLE-Zellen und werde sie einfach abzentrifugieren, um sie zu pelletieren. Eine Zentrifugation von acht bis zehn Minuten wird ausreichen. Nun haben wir unsere PLE-Zellen abzentrifugiert und verfügen über ein schönes Pellet.

Ich werde nun den Überstand entfernen und anschließend die roten Blutkörperchen lysieren. Dazu werde ich die Myozyten in Ammoniumchlorid suspendieren. Es handelt sich um eine Lösung mit einer Konzentration von 0,15 molaren Ammoniumchlorid, und ich werde fünf Milliliter pro Milz verwenden.

Da ich drei Milzen habe, werde ich 15 Milliliter Ammoniumchlorid verwenden und dies auf Eis durchführen. Um die Erythrozyten zu lysieren, werde ich die Probe sanft drei Minuten lang auf- und abpipettieren. Gut, wir verwenden hier diese Aufnahme mit der höheren Belichtung.

Jetzt habe ich die Elektrozyten drei Minuten lang analysiert. Ich werde mein Röhrchen mit PBS auffüllen, oder man könnte auch Medium verwenden. Das dient dazu, die Osmolarität der Lösung wieder in den für die Zellen normalen Bereich zurückzubringen.

Und ich werde die Zellen, wie zuvor, für acht bis 10 Minuten abzentrifugieren, um sie zu pelletieren. Danach wasche ich sie zweimal mit dem gleichen PBS mit Antibiotika. Nun zentrifugieren wir die Zellen nach der Isolierung der Elektrozyten, und machen Sie sich keine Sorgen – wir erhalten nie eine hundertprozentige Freisetzung der Elektrozyten.

Der Pellet bleibt also rot, aber das Überstand wird klarer sein. Nun werde ich den Überstand abgießen, den Pellet aufbrechen, etwas PBS bis auf 50 ml hinzufügen, erneut zentrifugieren und diesen Schritt noch einmal wiederholen, sodass ich insgesamt zwei Waschschritte durchgeführt habe. Danach kann ich die Zellen zählen. Ich habe die Myozyten zweimal gewaschen, sie anschließend in Kulturmedium resuspendiert und mit dem Zytometer gezählt.

Wie erwartet. Aus drei Milzen erhielt ich etwa 600 Millionen Zellen, was zu erwarten war, da eine Milz normalerweise 200 bis 250 Millionen Zellen liefert. Daher werde ich meine Zellen nun mit einer Dichte von 2 Millionen pro Milliliter in mein Medium aussäen, das mit 10% Fetalrinderserum ergänzt wurde.

Zu diesem Medium gebe ich zwei Mikrogramm pro Milliliter Concanavalin A hinzu, um die Zellen zu stimulieren. Danach werde ich die Zellen einfach für 48 Stunden in den Inkubator stellen. Die Zellen befinden sich nun seit 48 Stunden im Inkubator und, wie ich Ihnen zeigen werde, sind sie ziemlich gut gewachsen.

Das Medium hat sich orange verfärbt. Daher sind wir nun bereit, unsere Vorbereitung für das TCGF abzuschließen. Wie Sie sich erinnern, habe ich Concanavalin A in meine Zellsuspension gegeben, um die Zellen zu aktivieren.

Das Concanavalin A ist also ein Lectin. Es bindet an die Zuckerstrukturen aller Rezeptoren der T-Zelle und aktiviert künstlich alle diese Zellen. Das Problem, das wir nun haben, ist, dass noch etwas Concanavalin A im Überstand der Zellen vorhanden ist.

Und da wir einen snat in anderen T-Zell-Kulturen verwenden werden, um die Zellen zu expandieren, möchten wir das Con-Carnaval-A in diesen Zellkulturen nicht vorhanden haben. Um es zu entfernen, füge ich einen Überschuss an Zucker hinzu, an den Con-Carnaval-A bindet, nämlich Methyl-α-D-Cytat, das hier gezeigt ist. Ich werde einen Überschuss dieses Zuckers hinzufügen und ihn vollständig auflösen.

Es wird die gesamte verbleibende konzentrierte Navalsäure binden. Und sobald dies erledigt ist, werde ich meine Zellüberstände steril filtrieren und Aliquote einfrieren, um sie in den nächsten Wochen oder Monaten zu verwenden. Beginnen wir also mit diesem letzten Schritt. Ich gebe meinen Zellkulturüberstand in 50-ml-Röhrchen, um sie zentrifugieren zu können, um die Zellen zu entfernen.

Ich fülle also einfach so viele Röhrchen, wie nötig sind, und das mache ich nicht im Zellkulturwerkbank, obwohl ich es könnte. Da ich am Ende meine Lösung ohnehin filtrieren muss, weil ich den nicht sterilen Zucker hinzugebe, führe ich diesen Schritt einfach am Laborplatz durch. Das ist einfacher. Ich habe nun alle meine Zellen und das Überstandmedium in meine 50-ml-Falcon-Röhrchen umgegossen.

Ich werde sie nun zur Zentrifuge bringen und etwa 10 Minuten lang zentrifugieren. Der einzige Grund für das Zentrifugieren besteht darin, die Zellen zu einem Pellet zusammenzusammeln, damit klare Überstände entstehen. Die Zellen wurden mittlerweile abzentrifugiert, sodass der Überstand klar ist – genau das wollte ich gewinnen.

Ich werde nun den gesamten Überstand in einen sauberen 150 Quadratzentimeter fassenden Kolben sammeln. In diesen Kolben werde ich den Zucker geben. Während die Zellen abzentrifugiert wurden, habe ich ausreichend Zucker abgewogen, um 15 Milligramm pro Milliliter Überstand hinzuzufügen.

Ich werde es vollständig lösen lassen und danach mein Überstand steril filtrieren. Nun füge ich den Zucker mit 15 Milligramm pro ml Überstand hinzu. Ich setze die Kappe wieder auf, und da ich nicht unter sterilen Bedingungen arbeite, spielt es keine Rolle, ob etwas in die Kappe gelangt; ich mische, bis der gesamte Zucker gelöst ist.

Das sollte ziemlich schnell gehen. Ja, der gesamte Zucker ist jetzt gelöst. Jetzt muss ich nur noch das Überstand steril filtrieren und dann portionieren.

Normalerweise stelle ich Aliquote von 10 bis 15 ml her, die ich bei minus 20 Grad lagere. Solche Aliquote können mehrere Monate lang aufbewahrt werden. Sie können Ihr TCGF auch im Kühlschrank lagern, aber dann sollte es innerhalb der nächsten 10 bis 15 Tage verwendet werden.

In den letzten zwei Tagen habe ich Ihnen gezeigt, wie man T-Zell-Wachstumsfaktor herstellt, und dieses Supernatant ist sehr einfach herzustellen und äußerst kostengünstig in der Herstellung. Daher verwenden wir es häufig im Labor, um unsere T-Zell-Linien in Kultur zu halten, ohne teure Zytokin-Cocktails kaufen zu müssen. Viel Erfolg also bei Ihren Experimenten.