Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bedeutende translatio­nale Pausenstellen für ein mRNA-Molekül zu identifizieren und zu lokalisieren, das in einem zellfreien Translationssystem translatiert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gen der Wahl unter Kontrolle eines T-sieben-Transkriptionspromotors kloniert wird. Anschließend wird die mRNA transkribiert und gereinigt.

Anschließend wird die In-vitro-Translation in Gegenwart von mRNA und radioaktiven Aminosäuren durchgeführt, um das synthetisierte Protein und die naszenten Polypeptide zu markieren. Schließlich werden die Polysomen mittels Sedimentationsgeschwindigkeits-Zentrifugation isoliert, und die isolierten naszenten Ketten werden durch Gelelektrophorese getrennt. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die naszente Polypeptide unterschiedlicher Länge mittels Tristin-SDS-Page und Autoradiographie zeigen und somit die Anwesenheit von Pausenstellen entlang der mRNA von Interesse anzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu unseren bestehenden Methoden wie dem Mikrokernschutz-Assay liegt darin, dass sie äußerst einfach, schnell und effizient ist und die Bestimmung sowie Identifizierung der wichtigsten Translationsstartstellen entlang jeder MNA in einem gegebenen Zelltypsystem ermöglicht. Diese Methode kann helfen, einige zentrale Fragen auf dem Gebiet der Translation und der translationsgekoppelten Proteinfaltung zu beantworten, beispielsweise welche gesundheitsrelevanten Faktoren wie Codon-Nutzung, TNA-Angabe oder die sekundäre mRNA-Struktur die Translationskinetik beeinflussen könnten. Die Methode könnte darüber hinaus unser Verständnis der Beziehungen zwischen der Translationskinetik und den Schlüsselschritten im Weg der translationsgekoppelten Proteinfaltung vertiefen.

Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf das Verständnis des Prozesses der Proteinfaltung in vivo, der weitgehend als ko-translationale Ereignis während der Translation am Ribosom angesehen wird, obwohl die vorliegende Studie eine zellfreie Translation von Gamma-Bi-Kristallin unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Zellextrakts umfasst. Diese Technik kann ebenfalls eingesetzt werden, um translationsbedingte IDE in potenziell jedem Protein mithilfe eines translationskompetenten Extrakts, der aus einer beliebigen zellulären Quelle hergestellt wurde, zu identifizieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, bei zwei zentralen Schritten des Protokolls Schwierigkeiten haben.

Der erste Punkt ist die Ermittlung der gesamten Zeit, die für die Durchführung der Translationsreaktion erforderlich ist, um sicherzustellen, dass der Großteil der neu synthetisierten Polypeptide an das Ribosom gebunden bleibt. Der zweite Punkt besteht darin, ein geeignetes Gelsystem zur Auftrennung des Großteils der neu synthetisierten Polypeptide zu finden, wobei die Wahl des Gelsystems von der Größe des untersuchten Proteins abhängt. Wir hatten erstmals die Idee zu dieser Methode, als wir in den mittleren achtziger Jahren beschlossen, die Translationskinetik der Globin-Moleküle im Zusammenhang mit dem vorgeschlagenen Modell der COT-Translation-Faltung von Globin zu untersuchen.

Die Unregelmäßigkeit der Globin-Translation wurde erstmals 1974 von PRO und Maurice bemerkt, als sie die Größenausschlusschromatographie der Globin-NAS und -Ketten verwendeten. Ihre Analyse wies jedoch nicht die gewünschte Präzision auf, und Pro und mehr beobachteten vier Haupttranslationseffizienzstellen während der Globin-Translation. In der Folge ermöglichte unsere Analyse die Identifizierung von etwa 10 zusätzlichen Effizienzstellen und den Aufbau eines detaillierten Modells der translationalen Globinfaltung. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die hier beschriebene Technik die Isolierung von Polysomen und die Analyse naszierender Polypeptide mittels Tri-S-Ds-Seiten-Gel beinhaltet.

Beide Schritte sind entscheidend, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die Durchführung des Progel wird von einer Doktorandin aus dem Myelo-Labor Sujata For übernommen, die in vitro Transkription von Boten-RNA. Beginnen Sie mit einem Gen von Interesse, das unter einem T7- und/oder SP6-Promotor kloniert wurde; linearisieren Sie die DNA-Vorlage mithilfe eines geeigneten Restriktionsenzyms stromabwärts des Stopcodons und/oder des 3'-Endes der mRNA.

Ein Beispiel der Restriktionsverdauung zur Agarosegelelektrophorese, um zu überprüfen, ob die DNA vollständig linearisiert ist. Nach Bestimmung der optimalen DNA-Vorlagenkonzentration verwenden Sie ein Transkriptionskit, um nach Herstelleranleitung in vitro Messenger-RNA zu transkribieren. Anschließend reinigen Sie die mRNA mittels Lithiumchlorid-Fällung.

Verwenden Sie anschließend entweder Acrylamid- oder Aros-Gel-Elektrophorese, um die Reinheit zu überprüfen. Bereiten Sie eine 100 Mikroliter große In-vitro-Translation in nukleasefreiem Wasser vor, indem Sie eine Aminosäurenmischung ohne Methionin (1 mmolar), 10 Einheiten RNA-Inhibitor, 20 Mikrocurie radioaktives 35S-Methionin und Kaninchen-Reticulozyten-Lysat hinzufügen. Prewarmen Sie danach die Reaktion, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Anschießend zwei Mikrogramm mRNA zugeben und fünf Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren, um die Reaktion zu stoppen; anschließend auf Eis abkühlen, um an Ribosomen gebundene naszente Polypeptide zu isolieren. Die Übersetzungsreaktion vorsichtig auf 4,5 Milliliter 30 %igen Glycerin im Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) mit Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid schichten und mit einem TLA-110-Rotor-Zentrifugenapparat eine Stunde bei 100.000 × g und 4 Grad Celsius zentrifugieren. Danach das Überstandsvolumen vorsichtig abnehmen und das polysomale Pellet, das die naszenten Polypeptide enthält, in einem geringen Volumen (1 mmolarer Tris-HCl-Puffer, pH 7,6) mit 0,5 Milligramm pro Milliliter Ribonuclease A resuspendieren und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Um die Hydrolyse der Peptid-tRNA-Esterbindung zu verbessern, geben Sie Natriumhydroxid in einer Endkonzentration von 10 Millimolar zur Reaktion hinzu und inkubieren Sie diese weitere 30 Minuten. Trennen Sie die neu synthetisierten Polypeptide mittels Tris-Tris-SDS-Page, danach fixieren und trocknen Sie die Gele. Unterziehen Sie die Gele der Autoradiographie, gefolgt von einer Phospho-Bildgebung zur Detektion der neu synthetisierten Polypeptide.

Veränderte Ribosomenbewegungen, die durch Änderungen im tRNA-Pool hervorgerufen werden, sollten zu Veränderungen in der Größenverteilung der während der Translation akkumulierenden naszenten Polypeptide sowie zu Änderungen ihrer relativen Intensitäten führen, die die Dauer der Pause hier widerspiegeln. Naszente Polypeptide des Gamma-B-Crystallin-Proteins wurden isoliert und mittels Tristin-SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die nicht identischen Längen und Intensitäten der Polypeptide in den RRL- und E.-coli-Systemen zeigen, dass die Bewegung der Ribosomen entlang der mRNA in diesen beiden Systemen unterschiedlichen Translationskinetiken folgt.

Beispielsweise ist im e coli-Lysat eine auffällige Bande von 17,7 Kilodalton zu beobachten, die im Kaninchen-Reticulozyten-Lysatsystem nicht vorhanden ist. Gamma-B-Crystallin enthält tandemartig angeordnete Arginin-Codons, die in Säugetiersystemen häufig vorkommen, aber bekanntermaßen im e coli äußerst selten und langsam übersetzt werden, was darauf hindeutet, dass diese Bande durch das Anhalten des Ribosoms verursacht wird. An diesen tandemartig seltenen Codons, wie hier gezeigt.

Ohne mRNA können keine Banden beobachtet werden, und die Behandlung mit Purymycin entfernt die meisten naszierenden Ketten aus dem Polysom. Außerdem entfernt eine verlängerte Behandlung mit Purymycin sämtliche naszierenden Ketten, was bestätigt, dass die beobachteten Polypeptidprodukte ribosomassoziierte naszierende Ketten sind und keine MRPs, die mit dem Polysom mitpräzipitieren. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von ein bis zwei Tagen durchgeführt werden. Die Dauer des Verfahrens hängt hauptsächlich von der Dauer des Zentrifugationsschritts und des Schritts der Gelelektrophorese naszierender Peptide ab.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, die Übersetzungsreaktion unmittelbar nach der Inkubationszeit zu stoppen. Um eine Freisetzung des neu synthetisierten Polypeptids aus dem Ribosom zu vermeiden, ist es offensichtlich entscheidend, RNA zu jedem Zeitpunkt auszuschließen. Eine RNA-Kontamination könnte die Übersetzungseffizienz des Extrakts beeinträchtigen und zur Freisetzung des neu synthetisierten Polypeptids aus dem Ribosom im Anschluss an dieses Verfahren führen.

Weitere Ziele, wie zum Beispiel die Auswirkungen von mRNA-bindenden Proteinen auf die Effizienz der Ribosomenbewegung entlang einer bestimmten Nachricht, können nach ihrer Entwicklung ebenfalls untersucht werden. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Proteinfaltung den Weg, um die Rolle der Translation zu erforschen, die sich durch das Vorhandensein seltener Codons bei der translationalen Proteinfaltung ergibt. Diese Technik wurde zuvor bereits verwendet, um die Rolle von Kaliumsubstitutionen bei der Ribosomenbewegung entlang einer Nachricht und bei der translationalen Proteinfaltung zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man translatio­nale Aktivitätsstellen identifiziert, indem man an das Ribosom gebundene neu synthetisierte Polypeptide isoliert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Isotopen und markierten Aminosäuren, wie zum Beispiel A 35 Methionin, besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert und stets bei der Durchführung dieses Verfahrens berücksichtigt werden sollte.