Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bauchspeicheldrüse so zu dissezieren, dass die anatomische Orientierung erhalten bleibt. Dies wird erreicht, indem man den Dünndarm und die Milz von der Bauchspeicheldrüse entfernt und anschließend überschüssiges Fettgewebe und Gefäße von der Bauchspeicheldrüse ablöst. Der zweite Schritt besteht darin, die vordere Fläche mit blauer Tinte und die hintere Fläche mit schwarzer Tinte zu markieren.

Anschließend wird die Bauchspeicheldrüse in drei Regionen unterteilt. Jede Region wird dann quer in gleichmäßige Scheiben geschnitten und auf Paraffin-Kassetten, OCT-Formen gelegt oder weiter zerkleinert und in Röhrchen gegeben. Letztendlich werden Proben aus allen drei Regionen der Bauchspeicheldrüse gesammelt, wobei die korrekte anatomische Orientierung für die spätere Analyse erhalten bleibt.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen in der Forschung zum Typ-1-Diabetes zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen des Verlusts der Betazellmasse oder -funktion sowie die Art des Angriffs durch Immunzellen. Eine visuelle Demonstration der Pankreas-Verarbeitungsmethode ist entscheidend, da die Beibehaltung der in-vivo-Orientierung des Pankreas besondere Sorgfalt erfordert. Die Durchführung der Methode werden Linda Snyder, Histo-Technologin, und Emily Montgomery, Biologin, in meinem Labor demonstrieren.

Bereiten Sie zunächst alle für das Verfahren benötigten Materialien vor. Beschriften Sie zuerst die Kassetten, die die Paraffinblöcke enthalten, mit einer Spenderkennung, Probentyp, Aliquotnummer und allen weiteren erforderlichen Angaben. Danach beschriften Sie die OCT-Formen auf dieselbe Weise.

Schneiden Sie ausreichend Stücke Aluminiumfolie zu, um jeden OCT-Block einzeln einzuwickeln, und legen Sie diese für die spätere Verwendung beiseite. Bereiten Sie alle benötigten Gefäße zur Aufbewahrung der frischen und gefrorenen Proben vor. Fügen Sie gegebenenfalls später RNA und RPMI-Medium hinzu.

Bereiten Sie anschließend die Arbeitsbereiche vor, indem Sie Schneidbretter, sterilisierte Instrumente und alle anderen für den Eingriff benötigten Materialien sowohl in einer Sicherheitswerkbank als auch auf einer Arbeitsfläche bereitstellen. Ordnen Sie alle Kassetten und OCT-Formen entsprechend ihrer Verwendung an. Stellen Sie in der Nähe ein Gefriermittel her, indem Sie so viel Isopentan hinzufügen, dass das Trockeneis am Boden eines Styroporbehälters bedeckt ist.

Um die Dissektion zu beginnen, entfernen Sie Duodenum und Milz. Beginnen Sie damit, das Duodenum und die Bauchspeicheldrüse an einem Ende voneinander zu trennen, und setzen Sie dies fort, bis sie vollständig getrennt sind. Die Milz ist locker befestigt und lässt sich leicht vom Fettgewebe und der Bauchspeicheldrüse ablösen.

Als Nächstes reinigen Sie das Pankreas von überschüssigen Fettgefäßen und Nerven durch eine Kombination aus stumpfer und scharfer Dissektion. Legen Sie das Fett und die Lymphknoten beiseite, um sie später zu bearbeiten. Stellen Sie das gereinigte Pankreas auf ein mit Papiertüchern bedecktes Präparierbrett.

Die Beibehaltung der korrekten Orientierung der Bauchspeicheldrüse ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Um den Erfolg sicherzustellen, werden die vordere und hintere Oberfläche mit Tinte unterschiedlicher Farbe markiert. Tauchen Sie einen Wattestäbchenapplikator in blaue Tinte, verteilen Sie die Tinte auf der vorderen Oberfläche der Bauchspeicheldrüse und tupfen Sie den Überschuss ab.

Als Nächstes tauchen Sie einen neuen Applikator in schwarze Tinte und verteilen diese auf der hinteren Oberfläche der Bauchspeicheldrüse. Bringen Sie die Bauchspeicheldrüse in ihre normale Orientierung zurück. Mit der vorderen Fläche nach oben ist die Bauchspeicheldrüse nun bereit, in drei Abschnitte geschnitten zu werden.

Schneiden Sie zuerst die Verbindung zwischen Kopf und Körper durch. Teilen Sie danach den verbleibenden Teil in annähernd gleich große Abschnitte, um Körper und Schwanz voneinander zu trennen, und notieren Sie das Gewicht jedes Pankreasbereichs, beginnend mit dem Kopfbereich.

Teilen Sie jeden Bereich durch queres Schneiden, ähnlich wie beim Schneiden eines Brotlaibs, in etwa 0,5 cm lange Abschnitte. Sobald jeder Bereich der Bauchspeicheldrüse geschnitten wurde, entfernen Sie den letzten Abschnitt des Kopfbereichs, also den Übergangsbereich zwischen Kopf und Körper, und legen Sie ihn auf ein separates Präparationsbrett. Zerkleinern Sie diesen Abschnitt in kleine Stücke und verteilen Sie die Stücke gleichmäßig auf beschriftete Kryoröhrchen mit und ohne RNA.

Anschließend werden die Gefäße eingefroren. Gemäß den Standardverfahren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Bereich des Übergangs von Körper zu Schwanz.

Nachdem die zerkleinerten Proben gesammelt wurden, alle Querschnitte nach rechts kippen. Abwechselnd werden Schnitte aus jedem Bereich entfernt. Bei Paraffin- und OCT-Blöcken wird der erste Schnitt für die Paraffinblockierung entfernt.

Wenn ein Abschnitt zu groß ist, halbieren Sie ihn. Beschriften Sie die Kassetten mit A und B. Wenn das Stück immer noch zu groß ist, schneiden Sie jeden Abschnitt senkrecht zum vorherigen Schnitt und beschriften Sie die Kassetten im Uhrzeigersinn mit A bis D. Wie hier gezeigt, positionieren Sie die Kassette so, dass sich das Etikett links befindet.

Als Nächstes das Gewebe in die Kassette geben und den Deckel schließen. Die Kassette in einen Behälter mit neutral gepuffertem Formalin überführen. Nummerieren Sie den Block innerhalb jeder Region fortlaufend, beginnend mit dem medialsten Schnitt für OCT-Blöcke.

Gießen Sie eine dünne Schicht OCT-Medium in eine vorbeschriftete Form. Bevor Sie das Gewebe einführen, bedecken Sie das Gewebe mit OCT-Medium und gefrieren die Probe schnell ein, um sie später zu verwenden, wobei Sie zu dem zuvor beiseitegelegten Gewebe zurückkehren. Isolieren Sie die pankreatischen Lymphknoten, indem Sie das Fett- und Bindegewebe um die Knotenkapsel herum abschneiden. Legen Sie die Knoten in eine sterile Schale, die DMEF enthält, und zerkleinern Sie große Knoten in Stücke von nicht mehr als 0,5 Zentimetern.

Nachdem die Pankreas-Lymphknoten isoliert wurden, wird das Gewebe auf die vorbereiteten Gefäße und Kassetten zur weiteren Verarbeitung verteilt. Nach Abschluss der Lymphknoten wird die Milz zerkleinert und in ähnlicher Weise aufbewahrt. Um das Duodenum zu bearbeiten, verwenden Sie einen angefeuchteten Mulltupfer, um die Mukosa von Schleim zu befreien, schneiden Sie die Mukosa ab und teilen Sie sie anschließend in Abschnitte ein.

Teilen Sie die Schleimhautproben wie zuvor gezeigt auf. Mit diesem Verfahren werden repräsentative Proben aus jedem Bereich der Bauchspeicheldrüse, wie hier dargestellt, gesammelt. Die Gewichte der Kopf-, Körper- und Schwanzregion waren annähernd gleich.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine humane Bauchspeicheldrüse in verschiedene Probentypen verarbeitet, insbesondere wie man die Orientierung beibehält sowie wie man Lymphknoten aus dem peripankreatischen Fettgewebe isoliert.