Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Zellen oder DCs und Makrophagen aus der Mausdarmwand schnell zu isolieren, um sie phänotypisch und funktionell zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das Darmgewebe gewonnen wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Darmepithel von der Lamina propria zu lösen.

Anschließend wird die intestinale Lamina propria in den letzten Schritten des Verfahrens verdaut. Die Zellen der Lamina propria werden mit fluoreszenzmarkierten konjugierten Antikörpern gefärbt und für spezifische Zellpopulationen gezielt ausgewählt. Letztendlich können intestinale DC- und Makrophagenpopulationen genauer charakterisiert und für funktionelle Untersuchungen zur Beurteilung der Zytokinproduktion, der Antigenpräsentation und der Regulation von Immunzellen gereinigt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt also darin, dass die Schnelligkeit der Gewebeverdauung eine optimale Expression von Zelloberflächenantigenen, die Zellviabilität und die zellulären Eigenschaften gewährleistet. Nach der Tötung der Maus und Bestätigung des Todes mittels der Zehenquetschreflexprüfung, sprühen Sie 70 %igen Ethanol auf den Bauch- und Brustbereich des Tieres. Anschließend verwenden Sie eine Schere, um einen kleinen horizontalen Schnitt in der Mitte des Abdomens zu machen, und ziehen die Haut zurück, um das Peritoneum freizulegen.

Öffnen Sie das Peritoneum mit einer Schere, nachdem Sie am Pilo-Sphinkter geschnitten haben, um den Magen vom oberen Dünndarm zu trennen, und lösen Sie mit einer Pinzette das Mesenterium. Schneiden Sie erneut am Ileozökalklappenbereich, um den gesamten Dünndarm vom Dickdarm zu lösen. Setzen Sie die Trennung des Mesenteriums vom Dickdarm fort und führen Sie einen Schnitt am Analkanalrand durch.

Verwenden Sie eine Schere, um den Darm längs zu öffnen, und spülen Sie mit C-M-F-P-B-S bei Raumtemperatur die fäkalen Inhalte und den Schleim aus dem Darmlumen. Verwenden Sie anschließend die Schere und die Pinzette, um makroskopisch die Peyer-Plaques entlang der antimesenterialen Fläche des Dünndarms zu dissezieren und den Dünndarm längs zu eröffnen.

Als Nächstes spülen Sie den Dünndarm-Lumen mit weiterem C-M-F-P-B-S bei Raumtemperatur, um fäkale Inhalte und Schleim zu entfernen. Schneiden Sie Dünndarm und Dickdarm separat in etwa 1,5 cm lange Stücke und geben Sie diese in einzelne 50-Milliliter-Konischgefäße, die jeweils 30 Milliliter vorgewärmtes C-M-F-H-B-S-S mit FBS und zwei Millimolar EDTA enthalten. Stellen Sie jedes 50-Milliliter-Konischgefäß horizontal in einen Rüttelapparat und rütteln Sie die Gefäße 20 Minuten lang bei 250 U/min und 37 Grad Celsius.

Stellen Sie als Nächstes ein einziges Sieb mit Maschendraht über einen Abfalleimer. Gießen Sie den Inhalt jedes 50-Milliliter-Konischgefäße durch das Sieb, um die Darmstücke zurückzugewinnen, und geben Sie diese dann in neue einzelne 50-Milliliter-Konischgefäße, die 30 Milliliter vorgewärmtes C-M-F-H-B-S-S mit FBS und zwei Millimolar EDTA enthalten. Stellen Sie die Gefäße abschließend erneut 20 Minuten lang in den Rüttelapparat.

Nach der zweiten Schüttelphase gießen Sie den Inhalt jedes Röhrchens durch das Sieb. Tupfen Sie erneut die überschüssige Nährlösung mit einem Papiertuch ab und überführen Sie anschließend die Darmstücke in ein kleines, plastisches Petrischälchen. Der schwierigste Aspekt dieser Technik ist die Gewebeverdauung, um den Erfolg sicherzustellen. Dabei müssen alle verschiedenen Parameter wie Dauer der Verdauung, Eigenschaften des Kollagenasepräparats, Gewebestabilität und Größe des zu verdauenden Gewebes unter raschem Einsatz einer Schere berücksichtigt werden.

Zerkleinern Sie die Darmstücke und geben Sie den gehackten Darm in ein 50-Milliliter-Konischgefäß, das 20 Milliliter Kollagenase-Lösung enthält. Stellen Sie das Konischgefäß horizontal in den Rüttelapparat und verdauen Sie die Darmstücke 10 bis 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 200 U/min. Vortexen Sie das Gefäß nun kurz, um eine vollständige Dissoziation des verbleibenden Darmgewebes sicherzustellen, und filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 100-Mikron-Zellsieb direkt in ein 50-Milliliter-Konischgefäß.

Schließlich auffüllen des kegelförmigen Reaktionsgefäßes mit C-M-F-H-B-S-S mit FBS und Zentrifugation der Zellsuspension zweimal für jeweils fünf Minuten bei 425 × g und vier Grad Celsius. Anschließend den Überstand dekantieren und das Zellpellet in eiskaltem C-M-F-H-B-S-S mit FBS resuspendieren und die Proben auf Eis stellen. Nach der Färbung der Zellen für die gewünschten Oberflächenproteine.

Erstellen Sie zunächst ein Punktdiagramm, bei dem die Zellen ausgeschlossen werden, die positiv für die Totzellen-Färbung sind, wie hier gezeigt. Schließen Sie danach Doppelte-Ereignisse aus, wie hier und hier dargestellt. Verwenden Sie nun die Vorwärts- und Seitenstreuungskanäle, um auf die Zellen von Interesse zu selektieren, und achten Sie darauf, Zelltrümmer auszuschließen.

Erstellen Sie anschließend ein weiteres Punktdiagramm mit Toreinstellung auf das CD45-positive und IAB-positive Antigen. Stellen Sie die Zellen in einem separaten Punktdiagramm dar und definieren Sie Bereiche zur Unterscheidung spezifischer DC- und Makrophagensubtypen. Der hier gezeigte R1-Bereich erfasst die CD11c-positiven und CD11b-schwach-negativen Zellen.

Der R2-Bereich grenzt die Zellen ab, die ein ähnliches Maß an Oberflächenexpression von CD11c aufweisen wie die Zellen im R1-Bereich, aber zusätzlich CD11b exprimieren. Die R3-Bereiche kennzeichnen die Zellen, die CD11b-positiv und CD11c-schwach-negativ sind. Diese drei Bereiche können weiterhin hinsichtlich der Expression von F4/80 und CD103 analysiert werden, um Makrophagen- und DC-Populationen jeweils zu unterscheiden. Wie in diesem Punktediagramm zu sehen ist, exprimieren die CD11c-positiven, CD11b-schwach-negativen Zellen im R1-Bereich hohe Mengen des αE-Integrins CD103 und geringe Mengen von F4/80.

Dieses Punktdiagramm zeigt, dass CD11b-positive, CD11c-positive Zellen im R2-Bereich aufgrund ihres dichotomen Expressionsmusters von CD103 und F4/80 aus sowohl DCs als auch Makrophagen bestehen. Schließlich werden basierend auf ihrem F4/80-positiven und CD103-negativen phänotypischen Profil im R3-Bereich die selektierten CD11b-positiven, CD11c-negativen Zellen aus Makrophagen bestehen. Der Zusammenhang zwischen der Dauer der Gewebeverdauung und der Gesamtzellausbeute sowie der Expression von CD11b und CD11c wird in den folgenden sechs Abbildungen veranschaulicht. Darmgewebe, das drei Minuten lang verdaut wird, ergibt eine geringe Gesamtzahl an Zellen, was in nur wenigen zur Charakterisierung verfügbaren DCs und Makrophagen resultiert. Eine Gewebeverdauung über 11 Minuten führt hingegen zu einer hohen Ausbeute an lebenden Zellen und liefert Populationen von DCs und Makrophagen, die hohe Mengen an CD11b und CD11c exprimieren und phänotypisch klar voneinander abgrenzbar sind.

Im Gegensatz dazu führt eine Verdauung über 50 Minuten zu einer ähnlichen Zellausbeute im Vergleich zur optimierten Verdauung. Die Abgrenzung verschiedener Zellpopulationen mittels CD 11 B und CD 11 C wird jedoch schwieriger, da die Expression von CD 11 C abnimmt und die Anzahl toter Zellen zunimmt.

Bei Optimierung der Parameter für die Verdauung von Darmgewebe kann somit schnell eine hohe Zellausbeute erzielt werden. Folglich kann die schnelle Isolierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus der Mausdarmwand nützlich sein, um die funktionellen Eigenschaften von Immunzellen mit intakten Oberflächenantigenen zu bewerten.