Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

In diesem Video beschreiben wir ein zeiteffizientes und kostengünstiges Verfahren zur Expression sekretierter Proteine aus HEC 293T-Zellen. Zunächst wird eine 40 % konfluente HEC 293T-Zellkultur in einer Sechswellplatte vorbereitet. Anschließend wird ein Transfektionsgemisch hergestellt, indem Gene-Juice und Testplasmide in serumfreiem Medium verdünnt werden.

Das Transfektionsgemisch wird auf die Zellen aufgebracht, die anschließend bei 37 Grad Celsius inkubiert werden, um die Proteinsynthese zu ermöglichen. Der Nachweis des Proteins im Überstand kann mittels Western Blot durchgeführt werden. Sobald ein geeigneter Konstrukt identifiziert ist, kann das Verfahren mit 10-Schicht-Zellfabriken skaliert werden.

Die Zellen werden mittels PEI als Transfektionsreagenz transfiziert. Das Protein kann aus den Kulturüberständen mittels tangentialer Flussfiltration gefolgt von einer Affinitätschromatographie gewonnen werden. Letztendlich ermöglicht diese Plattform die Expression einer breiten Palette von Makromolekülen in Milligramm-Mengen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der auf dem Balo-Virus basierenden Insektenzell-Expression besteht darin, dass eine große Anzahl von Konstrukten innerhalb von drei Wochen auf ihre Expression hin untersucht und hochskaliert werden kann. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Hello Aiden für Shada Zini und Jonathan Cook übernehmen. Drei Doktoranden aus meinem Labor beginnen damit, dass sie 250.000 HEC 2 9 3 T-Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von einem Milliliter in einer 6-Loch-Platte ansäen, pro Vertiefung einen Milliliter 10 % FBS-PenStrep-supplementiertes DMEM hinzufügen und die Platte schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

Anschießend die Zellen über Nacht in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius inkubieren. Sobald die Zellen eine Konfluenz von etwa 40 % erreicht haben, das SUP natum durch zwei Milliliter frisches Medium ersetzen, um das Transfektionsgemisch vorzubereiten. Zunächst 90 Mikroliter serumfreies DMEM in ein Eppendorf-Röhrchen abpipettieren.

Anschließend drei Mikroliter GeneJuice, das Transfektionsreagenz, hinzufügen, den Inhalt des Röhrchens vorsichtig mischen und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Danach 10 Mikroliter einer 100 Nanogramm pro Mikroliter-Stammlösung des mini-präparierten, gereinigten Plasmids, DNA, zum Transfizieren hinzufügen.

Mischen Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes und lassen Sie ihn 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Um die Transfektion durchzuführen, geben Sie die Mischung auf die HEC 2 9 3 T-Zellen. Geben Sie die Mischung tropfenweise hinzu und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Transfektionslösung gleichmäßig zu verteilen.

Anschließend die Zellen bei 37 Grad Celsius inkubieren. 24 Stunden später ein Milliliter frisches Medium in jede Vertiefung geben und weitere 48 Stunden inkubieren. Drei Tage nach der Transfektion das Überstand aufsammeln und die Expressionsmengen des Proteins der Untersuchung mittels Western Blot nachweisen.

Nachdem ein geeigneter Konstrukt identifiziert wurde, kann das Transfektionsverfahren hochskaliert werden. Unter Verwendung von Zellfabriken mit 10 Schichten füllen Sie eine Zellfabrik mit 1,2 Litern DMEM, das mit 5 % FBS ergänzt wurde. Geben Sie anschließend 200 Millionen HEC 2 9 3 T-Zellen hinzu und verteilen Sie die Zellen gleichmäßig auf alle Schichten.

Vier T-225-Zentimeter²-Zellkulturgefäße, die bis zur 100 %igen Konfluenz herangewachsen sind, enthalten etwa 200 Millionen Zellen. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius. Bereiten Sie das Transfektionsgemisch in einem T-75-Gefäß vor, indem Sie 840 Mikrogramm DNA in 84 Milliliter sterilem 1×-PBS verdünnen.

Geben Sie 2,5 Milliliter einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter Polyethylen-Ion (PEI) hinzu und inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Lösung sollte trüb werden. Gießen Sie danach die Transfektionsmischung langsam in die Zellfabrik und verteilen Sie sie gründlich.

Gesamtschichten. Fügen Sie Valproinsäure in einer Endkonzentration von vier Millimolar hinzu. Dies erhöht die Expressionsausbeute, sobald das Transfektionsgemisch zugegeben wurde.

Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius für vier Tage, um die Proteingexpression zu ermöglichen. Sammeln Sie das Medium vier Tage nach der Transfektion und reinigen Sie unverzüglich die Zellfabrik zur Wiederverwendung; zentrifugieren Sie das gesammelte Medium bei 6.000 ×g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius und filtrieren Sie es durch eine 0,22-Mikrometer-Sterikuppel-Vakuumfilterapparatur, um Partikel zu entfernen. Anschließend konzentrieren Sie das Überstand mit dem Centra-Mate-Tangentialflussfiltrationssystem auf 75 Milliliter.

Nachdem das Überstandvolumen konzentriert wurde, kann das Protein von Interesse mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden. In diesem Experiment reinigten wir die HA-markierten Untereinheiten der extrazellulären Domäne der menschlichen AAL2-Rezeptoren unter Verwendung des hier beschriebenen Großmaßstabsystems, gefolgt von einer Hochaffinitäts-Chromatographie mit anti-THA. Wie in dieser kumasi-gefärbten SDS-Page-Analyse gezeigt.

Die extrazellulären Domänen der Interleukin-2-Rezeptor-alpha- und -gamma-Untereinheiten wandern bei den Molekulargewichten von 40 Kilodalton und 46 Kilodalton. Die Heterogenität der auf IL-2Rα und IL-2Rγ vorhandenen EnLink-Glykane führte zu einer Bandenverbreiterung im SDS-PAGE-Gel. Die Bande mit dem höheren Molekulargewicht stellt kontaminierendes BSA dar.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine aus menschlichen Zellkulturen unter Verwendung von 10-Schicht-Zellfabriken exprimiert werden können. Vergessen Sie nicht, dass HC 2 93 T-Zellen als biologisch gefährlich gelten und auf Biosicherheitsstufe zwei behandelt werden sollten. Tragen Sie stets geeignete persönliche Schutzkleidung, und Oberflächen sollten gemäß den Richtlinien Ihrer Institution und der behördlichen Vorgaben desinfiziert werden.