Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Das allgemeine Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die Kinetik und den Verlauf des Zellzyklus zu messen. Zunächst werden die Zellen kurzzeitig mit Bromodeoxyuridin oder BRDU markiert, das in die DNA der Zellen anstelle von Thymidin eingebaut wird. Anschließend werden die Zellen mit Antikörpern gegen BRDU immungefärbt und unmittelbar nach der Färbung per Durchflusszytometrie analysiert.

Nur Zellen in der S-Phase werden markiert, da die markierten Zellen im Verlauf des Zellzyklus in die G2-Phase übergehen. Nach der Mitose weisen sie einen DNA-Gehalt von 4N auf. Anschließend wird der DNA-Gehalt auf 2N reduziert. Somit kann anhand der durch die Durchflusszytometrie erzeugten Fluoreszenzprofile die Kinetik des Zellzyklusverlaufs bestimmt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Protokollen, die Chemikalien zur Zellsynchronisierung verwenden, liegt darin, dass keine physiologischen Störungen auftreten, die möglicherweise unbeabsichtigt die Zellteilungsmaschinerie beeinflussen könnten. Wir verwendeten diese Methode erstmals, als unsere Versuche, die Geschwindigkeit des Zellzyklusfortschritts mittels chemischer Synchronisierung zu untersuchen, unerwartete Ergebnisse lieferten, die unsere Analyse störten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten.

Beispielsweise, worin liegt die Grundlage für unterschiedliche Wachstumsraten zwischen verschiedenen Zelltypen? Beginnen Sie dieses Protokoll mit einer Pulse-Chase-Markierung der Zellen mit BRDU, um dies durchzuführen. Markieren Sie zunächst eine 10 cm-Platte für jeden Zeitpunkt sowie jeweils eine Platte für die folgenden Kontrollen.

Nur BRDU, nur PI, BRDU-negativ, PI-negativ: Aussaat jedes Probenträgers mit fünf mal 10 hoch fünf MCF-7-Zellen in ergänztem DMEM; Inkubation der Probenträger für 24 bis 48 Stunden, damit sich die Zellen erholen und anheften können. Sobald die Zellen eine Konfluenz von 60 % erreicht haben, Medium durch frisches DMEM mit 10 Mikromolar ersetzen.

BRDU: Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, um die Einlagerung von BRDU in die DNA zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass eine Platte unbehandelt bleibt, um als negativer Kontrollwert oder Zeitpunkt „Null“ nach einer Stunde zu dienen. Entfernen Sie das Puls-Markierungsmedium und waschen Sie die Zellen kurz mit PBS für die Zeitpunkte von zwei bis acht Stunden.

Frisches Wachstumsmedium hinzufügen und die Platten zurück in den Inkubator stellen. Anschließend sofort die Platten für den Zeitpunkt null und eine Stunde wie im nächsten Abschnitt beschrieben gewinnen. Zum Gewinnen der Zellen das Medium abpipettieren und die Platte spülen.

Einmal mit PBS waschen, dann die Zellen mit Trypsin behandeln, um sie von der Platte zu lösen, und in DMEM sammeln. Zentrifugieren bei 390 ×g für fünf Minuten. Den Überstand verwerfen. Anschließend die Zellen in ein bis fünf Milliliter kaltem PBS auf Eis waschen, erneut bei 390 ×g für fünf Minuten zentrifugieren, nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und die Zellen in 100 µL Eis resuspendieren.

Kaltes PBS mit 1 % FBS. Das FBS hilft, Zellagglomerationen zu verhindern. Einer der wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens ist, sicherzustellen, dass Sie eine Einzelzell-Suspension aus Ihren gewonnenen Zellen erhalten.

Für Fakten. Um dies zu erreichen, können Sie Ihre Zellen direkt tropfenweise dem Ethanol hinzufügen. Dies ist entscheidend. Um die Zellen zu fixieren, geben Sie die Zellen mit der Pipette tropfenweise zu fünf Millilitern eiskaltem Ethanol.

70 % Ethanol in einem 15-Milliliter-Konischgefäß. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis oder lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Dies ist ein idealer Arbeitsschritt, um die Probensammlung aus den verschiedenen Zeitpunkten zu unterbrechen; die Proben können mehrere Tage in Ethanol belassen werden, sodass sie anschließend gleichzeitig im weiteren Verlauf des Protokolls verarbeitet werden können, um BRDU- und Propidiumiodid-Färbung durchzuführen.

Entfernen Sie die Zellen von vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie sie bei 390 × g für fünf Minuten. Nach dem Zentrifugieren pipettieren Sie das meiste Fixans mittels Aspiration ab, wobei etwa 50 Mikroliter verbleiben. Anschließend wirbeln Sie die Probe im Vortex.

Um das Pellet aufzulösen und die DNA während des Wirbelns zu denaturieren. Langsam einen Milliliter 2 N HCl Triton X-100 tropfenweise hinzufügen und anschließend die Proben 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zellen durch Zentrifugation der Proben fünf Minuten bei 390 × g pelletieren, danach den Überstand vorsichtig abpipettieren und verwerfen.

Resuspendieren Sie das Zellpellet anschließend in einem Milliliter 0,1-molarer Natriumtetrahydroborat-Lösung. Nach der Zentrifugation saugen Sie die Zellen erneut ab und verwerfen den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet dann in 75 Mikrolitern BRDU-Färbung.

Mischen Sie und inkubieren Sie 45 Minuten bei Raumtemperatur, lichtgeschützt. Nach der Inkubation pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation wie zuvor und resuspendieren das Zellenpellet in einem Milliliter PBS, der fünf Mikrogramm pro Milliliter Perdiumiodid enthält. Wenn Sie die PI-positive Probe im Durchflusszytometer messen, erstellen Sie ein Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung-Diagramm, um die korrekte Größenverteilung der Zellen sicherzustellen.

Beide Parameter sollten auf einer linearen Skala dargestellt werden. Gleichzeitig sollte ein Diagramm von FL drei H gegen FL zwei W betrachtet werden, um die PI-Färbung im Vergleich zur Fluoreszenzimpulsbreite zu visualisieren. Dieses Diagramm dient dazu, ein Tor zu erstellen, um den Anteil der Zellen zu isolieren, die als Teil des normalen Verteilungsmusters des Zellzyklus angesehen werden.

Allgemein zeichnet sich dieses Verteilungsmuster durch zwei Zellhaufen mit jeweils zwei N- und vierfachem DNS-Gehalt der PI-Färbung aus, die die G1- und G2-Phasen des Zellzyklus repräsentieren. Eine Zellreihe zwischen diesen beiden Haufen repräsentiert die laufende DNS-Replikation, die in der S-Phase des Zellzyklus stattfindet. Erstellen Sie ein Diagramm, das die gezielten Zellen mit FL1-H beziehungsweise FITC auf logarithmischer Skala auf der Y-Achse und PI auf linearer Skala auf der X-Achse darstellt.

Diese Darstellung wird verwendet, um die verbleibenden Parameter mithilfe der verschiedenen Steuerelemente einzustellen sowie Daten zu sammeln. Platzieren Sie für die Analyse die Probe mit ausschließlich PI-Färbung im Ladeanschluss des Durchflusszytometers, und stellen Sie den Verstärkungsfaktor so ein, dass G1 etwa bei 200 auf der x-Achse liegt. Dies lässt sich in einem Histogramm der PI-Färbung leichter visualisieren.

Als Nächstes die Probe mit nur BRDU in die Ladeöffnung geben und laufen lassen. Passen Sie die Verstärkung so an, dass die beiden Zellpopulationen, BRDU-positiv und BRDU-negativ, auf der Darstellung erscheinen. Idealweise befinden sich die BRDU-negativen Zellen genau bei oder knapp unter 10 hoch eins.

Die letzte Kontrolle ist die BDU/slash-PI-Negativprobe. Führen Sie diese Negativkontrolle durch, um sicherzustellen, dass die Zellen in keinem der oberen oder rechten Quadranten erscheinen. Sobald die Parameter der verschiedenen Diagramme eingestellt wurden, ist der Durchflusszytometer kalibriert und bereit für die Analyse der BRDU- und PI-gefärbten Zellen. Sammeln Sie Daten von mindestens 10.000 PI-gegateten Zellen pro Probe.

Erstellen Sie anschließend mit Software wie FlowJo oder FACS Diva ein Diagramm von FITC gegen PI, wobei die Zellen aus dem PI-gegen-FL-two-W-Diagramm als PI-positiv eingegrenzt werden, um die proliferierende Population zu unterscheiden. Generieren Sie danach ein zweites Gate, um die BRDU-positive Population zu isolieren.

Dann, um den zeitlichen Verlauf des Zellzyklusfortschritts zu verfolgen, tragen Sie die Anzahl der BRDU-positiven Zellen mit G1- oder G2-Gehalt als Funktion der Zeit auf, um den Zellzyklusfortschritt und die Kinetik zwischen zwei kolorektalen Zelllinien, HT 29 und LS 180, zu vergleichen. Die Zellen wurden stündlich über einen Zeitraum von acht Stunden nach Entfernung des A-B-R-D-U-Pulses gesammelt.

Beim Vergleich der Kinetik der beiden Profile ist das Auftreten eines G1-Peaks bei t gleich vier Stunden nach BrdU in den LS 180-Zellen im Vergleich zum entsprechenden Zeitpunkt der HT 29-Zelllinie, die diesen Peak nicht aufweist, deutlich erkennbar. Dies deutet auf eine beschleunigte Zellzyklusprogression durch die G2-Phase des Zellzyklus hin. In der kolorektalen Zelllinie LS 180 wurde ein Zellzyklusprofil der Brustkrebs-Zelllinie erstellt.

MC-sieben-Zellen wurden stündlich über einen Zeitraum von acht Stunden gesammelt, nachdem der BRDU-Puls entfernt worden war. Die immunmarkierten Zellen und die DNA-Gegenfärbung wurden anschließend anhand ihrer fluoreszierenden Signale sortiert.

Wie hier zu sehen ist, durchliefen die CF7-Zellen den Zellzyklus deutlich langsamer als eine der beiden getesteten kolorektalen Zelllinien. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die metabolische Markierung von DNA in Kombination mit der Ernte zu bestimmten Zeitpunkten es Ihnen ermöglicht, die Kinetik des Zellzyklus zu verfolgen.