Computertomographie-gesteuerte Time-Domain diffuse Fluoreszenz-Tomographie in der Kleintiere für die Lokalisierung von Krebs-Biomarker

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Fluoreszenzbilder der Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors in einem orthotopen Gliom-Mausmodell zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem die linke Großhirnhemisphäre einer A IIC-Maus mit humanen U2 51-Gliomzellen, die grünes Fluoreszenzprotein exprimieren, infiziert wird. Nachdem sich der Tumor zwei Wochen lang entwickelt hat, erhält die Maus eine Injektion mit einem Cocktail aus zwei fluoreszierenden Tracern.

Das Tier wird anschließend an einem Röntgensystem für Kleintiere abgebildet, um die zur genauen Bildrekonstruktion erforderlichen anatomischen Daten zu gewinnen. Die Daten dienen der anatomischen Positionierung der Lichtquelle und der Detektorstandorte des optischen Tomographiesystems, und eine speziell angefertigte Software wird verwendet, um die Fluoreszenzdaten aufzuzeichnen und das endgültige Bild zu erstellen. Letztendlich kann diese Methode ein Bild eines Tumors basierend auf seiner Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktors unter Verwendung sowohl der Fluoreszenz- als auch der Röntgenbildgebung erstellen, deren Genauigkeit mit kontrastverstärkter Magnetresonanztomographie verglichen werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der auf ladungsgekoppelten Bauelementen basierenden Fluoreszenztomographie an kleinen Tieren liegt darin, dass die Einzelphotonenzählung mit Photomultiplierröhren eine deutlich höhere Empfindlichkeit und Dynamik bei der Lichtdetektion ermöglicht. Diese Methode kann letztendlich dazu verwendet werden, den Erfolg molekularer Therapien zu überwachen, indem die Expression ihrer Zielstrukturen gemessen wird. Während subkutane Tumore leicht mit nicht-tomographischen Verfahren mittels Oberflächenabbildung sichtbar gemacht werden können, ist dieses System darauf ausgelegt, durch Gewebe bis zu mehreren Zentimetern Dicke abzubilden und eignet sich daher besonders gut zur Darstellung von Kontrastmittelaufnahme und -austritt in Gehirntumore.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Expression von Krebsbiomarkern ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Krankheitsstudien anwenden, wie beispielsweise Infektionen, Adipositas oder altersbedingte Erkrankungen wie Alzheimer. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der diffusen Ausbreitung von Licht in biologischem Gewebe und der Herausforderungen bei der Anwendung der Röntgen-Tomographie zur Rekonstruktion des diffusen Lichts. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend.

Da die Schritte zur Datensammlung und Bildrekonstruktion schwer zu erlernen sein können, ist es wichtig sicherzustellen, dass die aus dem fluoreszierenden System gewonnenen Daten gut kalibriert sind. Das nahezu schnelle Softwarepaket wurde entwickelt, um optische Daten einzulesen und die Röntgentomographie-Bilder zu nutzen, um ein Finite-Elemente-Netz zu erstellen, das als räumliche Vorlage für die Fluoreszenzrekonstruktion dient. Beginnen Sie damit, eine anästhesierte athymische Nacktmaus auf ein steriles chirurgisches Tuch zu legen, und überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, bevor Sie fortfahren. Reinigen und desinfizieren Sie die Haut über dem Operationsbereich.

Unter Verwendung von Betadine wird mit einem Skalpell ein steriles chirurgisches Tuch über die Schnittstelle gelegt und ein kleiner Schnitt leicht links der Mittellinie und 0,5 Zentimeter hinter der intraokularen Linie angelegt. Die Schädeloberfläche wird gereinigt, indem Bindegewebe entfernt wird, damit die Orientierungspunkte identifiziert werden können. Sobald der Schädel freigelegt ist, wird mit einem Hochgeschwindigkeitsbohrer und einem sterilen Bohrer mit einem Durchmesser von einem Millimeter ein Loch angefertigt, das zwei Millimeter links der Mittellinie und zwei Millimeter hinter dem bgma liegt.

Laden Sie eine Hamilton-Micros-Spritze mit einer stumpfen 27-Gauge-Nadel mit den zu implantierenden Zellen. Bringen Sie die Maus anschließend auf einen stereotaktischen Halter an. Überprüfen Sie dann eine tiefe chirurgische und ästhetische Ebene durch einen Zehenquetschtest und ersetzen Sie die chirurgische Abdeckung am Tier.

Befestigen Sie als Nächstes die beladene Spritze am stereotaktischen Rahmen. Positionieren Sie die Spritze über dem Loch im Schädel und führen Sie die Nadelspitze drei Millimeter unterhalb der Schädeloberfläche ein. Ziehen Sie anschließend die Nadel um einen Millimeter zurück, um eine Tasche zu bilden.

Der nächste Schritt besteht darin, die Zellen über einen Zeitraum von fünf Minuten langsam in die linke Großhirnhemisphäre zu injizieren. Sobald die Injektion abgeschlossen ist, ziehen Sie die Nadel heraus und desinfizieren die Öffnung mit Betadine. Um ein Wachstum der Zellen außerhalb der Injektionsstelle zu verhindern, nehmen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und füllen die offene Stelle mit vorgewärmtem Knochenwachs.

Schließen Sie die Inzisionsstelle abschließend mit einer sterilen 5-0-Nylon-Naht. Stellen Sie die Maus in einen beheizten Käfig zurück und überwachen Sie sie, bis sie sich erholt hat. Nach der Erholung injizieren Sie der Maus 130 µL Buprenorphin (0,1 mg/kg) i.p. und lassen Sie den Tumor 14 Tage vor der Bildgebung wachsen. Am Tag der Bildgebung der Maus starten Sie das System, um den Lasern und Lichtdetektoren etwa 20 Minuten zum Aufwärmen zu ermöglichen.

Um Drifts und Systemempfindlichkeit zu vermeiden, platzieren Sie einen maßgeschneiderten Linien-Diffusor mit 100 Grad durch vier Grad exakt in der Mitte des Abbildungs-Gantry, um die Anregungslaser gleichmäßig auf die Detektionskanäle des Systems zu verteilen. Stellen Sie den Winkel des Diffusors manuell ein, um die von allen fünf Lichtsammelkanälen detektierte Signalmenge zu maximieren. Danach platzieren Sie die optische Dichte.

Zwei Neutraldichtefilter vor allen Fluoreszenz-Detektions-Photomultipliern, sogenannten PMTs, und optischer Dichte. Ein Neutraldichtefilter vor jeder Durchlassmessung. Die PMTs erfassen 100 zeitliche Impulsverbreiterungsfunktionen oder T-PSFs des Lasers, jeweils mit einer Integrationszeit von einer Sekunde für jeden Laser nacheinander, normalisieren jede T-PSF durch das Laserreferenzsignal, korrigieren zeitliche Drift im Laserreferenzsignal und mitteln über alle Wiederholungen für jeden Detektor und jeden Laser separat.

Diese durchschnittlichen TPS sind die detektorspezifischen Geräteantwortfunktionen, die 12 Stunden vor dem bildgebenden Verfahren bei der optischen Bildrekonstruktion verwendet werden. Injizieren Sie die Testmaus mit einem Cocktail aus fluoreszierenden Tracern. Eine genaue Kalibrierung des Fluoreszenz-Tomographiesystems und die Beschränkung der Tierbewegung sind die schwierigsten Aspekte dieses Verfahrens.

Die Bildrekonstruktion ist derart schlecht konditioniert, dass bereits geringe Fehler bei der Datenerfassung zu erheblichen Fehlern im rekonstruierten Bild führen können. Um eine genaue Datenerfassung sicherzustellen, immobilisieren wir die Maus so gut wie möglich und wiederholen die Kalibrierung vor und nach dem Scannen, um die Wahrscheinlichkeit einer genauen Kalibrierung zu erhöhen. Sobald alles vorbereitet ist, platzieren Sie das anästhetisierte Tier auf den Glasfaserauflagen der Abbildungsunterlage.

Nachdem der Kopf in die Nasenkappe für die kontinuierliche Gasanästhesie positioniert wurde, befestigen Sie die Zähne am Bissbrett und fixieren Sie das Tier mit Klebeband. Die Maus sollte sich ungefähr in der Mitte des Bildgebungsgantry befinden. Diese Positionierung kann durch eine Drehung des Anregungslasers um 180 Grad um die Maus herum erfolgen, wobei sichergestellt werden muss, dass der Fokuspunkt des Lasers aus der Perspektive des Lasers unter allen Winkeln etwa den Mittelpunkt der Maus beleuchtet.

Nach korrekter Positionierung wurde die Imaging-Bahre gemeinsam mit der Maus vorsichtig auf den Mikro-CT-Scanner übertragen und anatomische Informationen mit einer isotropen Auflösung von 93 µm für den gesamten Kopf der Maus aufgezeichnet. Visualisieren Sie den CT-Bild-Stack und wählen Sie die Schnitte aus, die mit dem Fluoreszenz-Tomographiesystem abgebildet werden sollen. Übertragen Sie die Imaging-Bahre und die Maus anschließend vorsichtig zurück zum Fluoreszenz-Tomographiesystem.

Wählen Sie die Anzahl der Quellenpositionen für jeden Bildgebungsschnitt, die Integrationszeit für jede TPSF-Messung, die Anzahl der Wiederholungen pro Quellenposition sowie Position und Anzahl der gewünschten Bildgebungsschnitte aus dem zuvor erstellten CT-Bildstapel. Danach platzieren Sie Filter vor den Fluoreszenz-Detektor-PMTs, um das gesamte Anregungslicht zu blockieren, und optische Dichte-Neutraldichtefilter vor den Transmitanz-Detektor-PMTs. Um eine Sättigung dieser Detektoren zu vermeiden, führen Sie die Datenerfassungssoftware aus, um Fluoreszenz- und Transmitanz-tPSFs an jeder definierten Quellen-Detektor-Position bei beiden Anregungswellenlängen aufzuzeichnen.

Überwachen und dokumentieren Sie für jeden Satz der erfassten T-PSFs die Laserintensität mit einem Referenz-PMT-Kanal. Bestimmen Sie die äußere Oberfläche der Maus und die Position der Abbildungsebene. Unterstützen Sie Stäbe anhand der CT-Bilder und erstellen Sie Masken, die den Bereich der Maus und des Abbildungsstabes abdecken.

Verwenden Sie separat die Mausmaske, um mit der Near Fast-Software ein Finite-Elemente-Netz des Tieres zu erstellen. Lokalisieren Sie die Quellen- und Detektorpositionen des Fluoreszenztomographiesystems an der Oberfläche des Netzes basierend auf den räumlichen Registrierungskoordinaten von Mikro-CT und Fluoreszenz. Entfernen Sie optische Datensätze, die mit Quellen- oder Detektorpositionen assoziiert sind und mit der Position der Bildgebungsliege interagieren.

Stützstäbe normalisieren die an jeder Quelle-Detektor-Position gesammelten Daten durch den Laserreferenzwert, korrigieren zeitliche Drifts im Laserreferenzsignal und berücksichtigen die Filterempfindlichkeiten, die durch experimentelle Tests beim Kauf ermittelt wurden. Bilden Sie das Born-Verhältnis der Daten für jede Quelle-Detektor-Position und multiplizieren Sie es mit einer Vorwärtsmodell-Simulation der Transmission, basierend auf dem Finite-Elemente-Tiermodell mit einheitlichen optischen Eigenschaften. Dies dient dazu, Fehler aufgrund der Kopplung von Quelle oder Detektor an das Gewebe zu verringern, die Daten an das Modell zu kalibrieren und Anpassungen für weitere Aspekte der Diskrepanz zwischen Modell und Daten vorzunehmen. Konstruieren Sie einen Datenvektor, der aus der skalierten Differenz der Born-Verhältnis-Daten besteht, die bei beiden Wellenlängen erfasst wurden.

Der Skalierungsfaktor wird so gewählt, dass der Bindungskontrast von EGFR maximiert wird, anschließend erfolgt die Rekonstruktion des Zeitbereichsbildes mit den kalibrierten Differenzdaten unter Verwendung der TPSF für jeden Detektionskanal als Eingabe und die Erstellung von Fluoreszenzkarten des kontrastverstärkten gezielten Tracers. Hier ist ein Beispiel einer Fluoreszenzrekonstruktion, überlagert mit einem koregistrierten CT-anatomischen Bild einer Maus mit einem U2 51 orthotopen Gliomtumor. Der Schwerpunkt des Glioms, ermittelt mittels Fluoreszenzrekonstruktion, lag innerhalb eines Millimeters vom Tumorschwerpunkt, der durch kontrastverstärkte Magnetresonanztomographie bestimmt wurde.

Die Software zur Datenaufnahme ist speziell für dieses Gerät angefertigt, doch die meisten Bildverarbeitungstechniken können mit der nahezu schnellsten verfügbaren Software unter@nearfasts.org durchgeführt werden. Daher ist es bei Durchführung dieses Verfahrens wichtig sicherzustellen, dass sowohl das System als auch die Daten vor der Bildrekonstruktion genau kalibriert sind. Diese Kalibrierung erfordert, dass die Empfindlichkeit und die zeitlichen Unterschiede zwischen den Detektoren berücksichtigt werden, nach der Bildrekonstruktion eines auf einen Biomarker abzielenden Tracers.

Die ähnliche Bildgebung eines nicht gezielten Tracers ermöglicht eine Korrektur für nicht rezeptorvermittelte Aufnahme. Dies erlaubt die Quantifizierung der Tracer-Bindungsmenge sowie der in vivo Rezeptordichte nach ihrer Entwicklung. Diese Technik inspirierte andere Forscher zur Entwicklung von röntgenbildgesteuerten Fluoreszenztomographie-Systemen und ebnete den Weg für die Ganzkörperbildgebung größerer Tiere.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Experiment zur diffusen Fluoreszenztomographie durchführt, das röntgenbasierte anatomische Bildgebung und optische Bildgebungssysteme für die Bildgebung von Krebsbiomarkern kombiniert.