Understanding Cerebellar Musterbildung

Ich bin Kathy Millan. Ich bin Assistenzprofessorin an der Universität von Chicago in der Abteilung für Humangenetik sowie in der Abteilung für Neurologie. Ich forsche zur Gehirnentwicklung und beschäftige mich insbesondere mit der Entwicklung des Cerebellums, des Kleinhirns, dem Teil des Gehirns, der sich hier hinten im Bereich des Hinterkopfes befindet.

Und es ist vor allem für seine Rolle bei der motorischen Entwicklung bekannt, aber es stellt sich heraus, dass es an vielen Prozessen beteiligt ist. Und es ist ein wirklich faszinierender Teil des Gehirns. Die Musterbildung ist die Entwicklung von Mustern in einem biologischen System. Und es ist eines dieser Wörter, die Entwicklungsbiologen etwas vage verwenden, um fast alles zu bezeichnen.

Und es ist nicht wirklich klar, was damit gemeint ist. Ich denke, jeder Entwicklungsbiologe würde Ihnen eine andere Version dessen nennen, was es für ihn bedeutet. Es bedeutet, wie das Gehirn oder insbesondere das Kleinhirn, oben und unten unterscheidet, wie definiert man links und rechts?

Wie entscheidet sich, welcher Teil der Struktur was wird, welcher Teil? Und sobald diese entscheidenden, grundlegenden embryonalen Entscheidungen getroffen sind, wie fügt man dann die gesamte zelluläre Struktur zusammen, um den exquisit gemusterten Teil des Gehirns zu bilden, den wir Kleinhirn nennen? Wir interessieren uns also wirklich für die Entwicklung des Kleinhirns und für Musterinformationen im sich entwickelnden Kleinhirn.

Da das Kleinhirn ein äußerst fein strukturiertes Gewebe ist. Es weist nicht viele Zellschichten und nicht viele Zelltypen auf. Im Vergleich zu anderen Teilen des Gehirns ist es daher besonders, nun ja, eine relativ einfache Struktur.

Und außerdem, weil das Kleinhirn eine ganz spezifische Funktion hat, beziehungsweise eine von vielen Funktionen die motorische Koordination ist. Wenn Mäuse oder Menschen zerebelläre Auffälligkeiten aufweisen, ist eines der resultierenden Phänotypen eine motorische Unkoordination. So gab es im Laufe der ungefähr hundert Jahre der Mausgenetik zahlreiche spontane Mausmutanten, die bis zu einem gewissen Grad entdeckt und charakterisiert wurden, aber auch einfach isoliert und in den Regalen von Jackson Labs lagerten, wo sie als Mäuse mit motorischen Auffälligkeiten aufbewahrt wurden.

Und eine große Zahl dieser Mäuse – meiner Ansicht nach über etwa 60 spontane Stämme – weist zerebelläre Entwicklungsstörungen auf. Diese Ressource ist eine äußerst wertvolle Grundlage, um die Entwicklungsmechanismen zu untersuchen, die die Musterbildung im Kleinhirn steuern. Ein Schwerpunkt meiner Arbeitsgruppe liegt daher darauf, alle verfügbaren Werkzeuge aus dem Human Genome Project und dem Mouse Genome Project zu nutzen und mit diesen molekularen Reagenzien die Gene zu identifizieren, die in all diesen spontanen Mutanten verändert sind.

Und indem wir diese Mutanten finden, verfolgen wir einen phänotypzentrierten Ansatz zur Identifizierung von Genen. Wir nehmen also nicht zufällig Gene und inaktivieren sie. Stattdessen finden wir Phänotypen und leiten daraus die Gene ab, denn mit diesem Ansatz identifizieren wir gezielt Gene, die besonders relevant für das betreffende System sind.

Unser Labor und viele andere Labore haben eine Reihe dieser spontanen Mausmutanten kloniert. Diese spontanen Mausmutanten haben zu wirklich interessanter neuer Biologie geführt, da wir einen phänotypbasierten Ansatz verfolgen.

Wir haben keine Vorannahmen darüber, welche Art von Genen wir finden werden. Wir suchen nicht gezielt nach Dal-ho-Analoga oder Kanalmutationen. Wir gelangen zu den Genen, die durch die Phänotypen vorgegeben sind.

Und deshalb lernen wir eine Menge neuer biologischer Zusammenhänge kennen. Ein Beispiel dafür ist eines der Gene oder eines der Phänotypen, an denen mein Labor gearbeitet hat, und zwar gemeinsam mit einem weiteren Kollegen, Jim Linig, als ich Postdoktorand war. Wir arbeiteten an einem Mausmutanten namens dre, was im Deutschen „Kreisel“ oder „sich drehen wie ein Kreisel“ bedeutet. Diese Mausmutanten tauchten erstmals 1929 in Deutschland auf und haben sich seitdem bei Jackson Labs angesammelt.

Es gibt mehrere Allele dieses bestimmten Locus, und es war bekannt, dass das Kleinhirn fehlerhaft ausgebildet war. Somit waren alle Kleinhirnzelltypen vorhanden, aber die Struktur des Kleinhirns war abnormal. Der mittlere Teil fehlte; dieser mittlere Teil wird als Vermis bezeichnet.

Und wir entdeckten, dass es bei diesen Mäusen ein frühes embryonales Phänotyp gab, das zum erwachsenen Phänotyp führte. Das Phänotyp war das Ergebnis einer Mutation in einem Gen namens LMX one A, was für limb homeo domain containing box one steht. Das LMX one A-Gen hat sich daher zu einem äußerst interessanten und wichtigen Gen in der Entwicklungsbiologie entwickelt, da es eines der entscheidenden Gene bei der Bestimmung dessen ist, was oben oder dorsal im zentralen Nervensystem liegt.

Und ohne diese seltene Mutation wusste niemand genau, welche Funktion dieses Gen hat. Tatsächlich war es aus anderen Gründen in insulinproduzierenden Zellen der Bauchspeicheldrüse gefunden worden. Andere Forscher hatten es bereits auf eine mögliche Rolle bei Diabetes untersucht.

Doch tatsächlich zeigt es sich, dass LMX1A allein keinerlei Rolle in der Pankreasentwicklung oder der Entwicklung der Eyelet-Zellen spielt. Tatsächlich besteht seine Hauptfunktion in der Entwicklung darin, die dorsale Musterbildung im zentralen Nervensystem voranzutreiben. Als wir das DR-Gen, das LMX1A-Gen, erstmals klonierten, erkannten wir, dass es ausschließlich im dorsalen Bereich des zentralen Nervensystems exprimiert wird.

Und tatsächlich wird es nicht nur im dorsalen Teil des zentralen Nervensystems oder in der sogenannten Dachplatte nahe dem Kleinhirn exprimiert. Es wird vielmehr entlang der gesamten Achslänge des Maus-Embryos im dorsalen Teil des zentralen Nervensystems exprimiert. Und tatsächlich wird es entlang der gesamten Achslänge jedes Wirbeltiers exprimiert, das wir bisher untersucht haben.

Und da es überall dorsal exprimiert wird, folgerten wir, dass es auch dorsal in anderen Teilen des zentralen Nervensystems eine Rolle spielen muss. Daher haben wir tatsächlich viel Zeit damit verbracht, das Phänotyp der DR-Mäuse im Rückenmark zu charakterisieren, da das Rückenmark ein wesentlich besseres Modellsystem zum Verständnis der Entwicklung des ZNS ist als das Kleinhirn, weil es weitaus weniger dreidimensional kompliziert ist. Es weist eine deutlich geringere dreidimensionale Struktur auf.

Indem wir zum Huhn wechselten, konnten wir tatsächlich eine große Anzahl von Reagenzien nutzen, um die Rolle von LMX1A im Rückenmark zu entschlüsseln. Anschließend kehrten wir vom Rückenmark zurück zum Kleinhirn. Ehrlich gesagt glaube ich nicht, dass wir ohne die Technologie der Hühnerembryonenkultivierung ein tiefes Verständnis dafür erlangt hätten, was das Gen LMX1A tut. Ein Postdoktorand in meinem Labor, Victor Chiko, war die Person, die diese Experimente übernahm und vorantrieb.

Und er war es, der tatsächlich herausfand, was das LMX1A-Gen tut, und dessen primäre Rolle im zentralen Nervensystem mithilfe des Hühnchenelektroporationssystems. Ehrlich gesagt glaube ich nicht, dass wir so große Fortschritte hätten erzielen können, ohne die Hühnchenelektroporation. Die Hühnchenelektroporation ist daher eine äußerst wertvolle Technologie, da man Gene schnell im sich entwickelnden Nervensystem des Hühnchens überexprimieren kann, bereits nach zwei bis drei Tagen Inkubation ein Ergebnis erhält und analysierbare Phänotypen bekommt.

Wenn Sie tatsächlich versuchen würden, Genmanipulationen an Mäusen für transgene Tiere durchzuführen, würde dies mehrere Monate dauern, und für Knockouts usw. würde es mindestens eineinhalb Jahre dauern. Das Hühnchen-Expressionsystem ist daher ein besonders wertvolles System, da man die Genexpression gezielt verändern und Phänotypen rasch untersuchen kann. So verursachte die Überexpression von LMX1A im sich entwickelnden Nervensystem des Hühnchens, insbesondere im sich entwickelnden Rückenmark, dass der gesamte dorsale Teil des Zentralnervensystems bzw. des Rückenmarks sich in einen dorsalen Teil des Zentralnervensystems oder in die Dachplatte verwandelte.

Und das hat uns zusammen mit einer Reihe weiterer Experimente, die Victor durchgeführt hat, gezeigt, dass LMX1A allein verantwortlich ist für die Steuerung des gesamten Differenzierungsprogramms des Dachplättchens. Das ist wichtig, weil das Dachplättchen ein entscheidendes Signalzentrum im sich entwickelnden Nervensystem darstellt. Wenn kein Dachplättchen vorhanden ist, werden keine Morphogene ausgeschüttet, um benachbarte Zellen des Neuralrohrs anzuweisen, sich in dorsale sensorische Neuronen umzuwandeln.

Und ohne diese Signale gehen diese Zellen in einen Standardzustand eines intermediären Zelltyps über. Dabei gehen die meisten dorsalen Neuronen im Rückenmark, aber auch im sich entwickelnden Kleinhirn verloren. Ich glaube nicht, dass wir mithilfe eines anderen Systems so leicht zu diesem Schluss gekommen wären, außer mit dem Neuralrohr des Huhns.

Wir beschäftigen uns besonders mit der Entwicklung des Kleinhirns, nicht nur wegen der grundlegenden Biologie in Mäusesystemen und auch im Huhn, sondern auch, weil Menschen Kleinhirnfehlbildungen aufweisen. Diese menschlichen Kleinhirnfehlbildungen sind jedoch sehr schlecht verstanden. Daher haben wir gemeinsam mit einem Kollegen, Dr. William Dobbins, einem der weltweit führenden Experten für menschliche Gehirnfehlbildungen, ein Projekt initiiert, um Gene zu identifizieren, die menschliche Kleinhirnfehlbildungen verursachen.

Und wir verfolgen mehrere Ansätze. Eines der wichtigsten Dinge, die wir unternommen haben, ist der Aufbau einer DNA-Datenbank und einer klinischen Datenbank, in die wir über 500 Patienten mit definierten humanen Kleinhirnfehlbildungen eingeschlossen haben, bei denen wir MRT-Bilder gesammelt und diese mit DNA-Proben korreliert haben, um diese Ressource für die Genjagd nutzen zu können, da sich herausstellt, dass humane Kleinhirnfehlbildungen bisher überhaupt nicht gut kategorisiert sind. Ehrlich gesagt, würde ich sagen, dass von jeweils zehn Scans, die wir im Rahmen unserer Studien erhalten, mindestens einer eine Fehlbildung darstellt, die noch nie zuvor beschrieben wurde und bisher kaum erkannt worden ist.

Die häufigste menschliche Fehlbildung des Kleinhirns wird als Dandy-Walker-Malformation bezeichnet und ist diejenige, die von Klinikern am meisten erkannt wird. Es stellt sich jedoch heraus, dass sie so etwas wie eine Auffangdiagnose in der Welt der Kleinhirnfehlbildungen darstellt. Jeder Arzt oder viele Ärzte klassifizieren eine auffällige Kleinhirnstruktur als Dandy-Walker, sobald sie eine abnorme Befundung sehen.

Und so rekrutieren wir Patienten für unsere Studie zur Dandy-Walker-Missbildung und finden alle möglichen unterschiedlichen, interessanten zerebellären Missbildungen. Wir nutzen diese Ressource daher, um neue Gene, die an der Entwicklung des Kleinhirns beteiligt sind, zu identifizieren, denn als Entwicklungsbiologe bin ich der Ansicht, dass der Mensch ein großes, natürliches Mutagenese-Experiment darstellt. Er ist eine hervorragende Quelle, um neue Entwicklungs-Gene zu entdecken.

Wir verfolgen daher mehrere Ansätze, um diese Gene zu finden. Einer dieser Ansätze besteht darin, Gene, deren Funktion in der Entwicklung des Kleinhirns bei der Maus bereits bekannt ist, bei Menschen zu sequenzieren. Tatsächlich haben wir kürzlich die allererste humane LMX1A-Mutation identifiziert.

Bisher gab es wirklich nur begrenzte Anwendungen unserer Grundlagenforschung in der klinischen Forschung. Doch das ändert sich derzeit sehr schnell. Da wir immer neue Gene entdecken, können wir betroffenen Familien neue Informationen für die genetische Beratung bereitstellen.

Und ehrlich gesagt, sehe ich dort die größte Wirkung unserer Forschung. Meine Vision für das Fachgebiet in den nächsten fünf Jahren ist daher, dass wesentlich mehr Genentdeckungen erfolgt sein werden, sowohl durch die Charakterisierung von Mausmodellen als auch durch Untersuchungen menschlicher zerebellärer Fehlbildungen. Wir werden dann mehr über den Satz an Genen wissen, die an der zerebellären Entwicklung beteiligt sind.

Und dann wird das Ziel darin bestehen müssen, wie diese Gene miteinander interagieren und wie diese Gene die eigentliche Biologie steuern. Wie steuern sie alle unterschiedlichen zellulären Vorgänge, die ablaufen, um ein Kleinhirn zu bilden? Und ich denke, das Kleinhirn ist wirklich ein ideales Modell für das gesamte zentrale Nervensystem, denn ehrlich gesagt gibt es dort nur fünf bis sieben hauptsächliche neuronale Zelltypen.

Sie sind alle auf unterschiedliche, charakteristische Weise angeordnet. Wir gewinnen zunehmend mehr Erkenntnisse über die Moleküle, die die Spezifikation und die frühe Differenzierung dieser Vorläuferzellen steuern. Außerdem verstehen wir immer besser, wie sich diese Zellen vermehren.

Ich denke, dass dies mehr als fünf Jahre in Anspruch nehmen wird, aber letztendlich sehe ich die Möglichkeit, dass das Forschungsfeld in der Lage sein wird, die Entwicklung vom Neuralrohr bis hin zur vollständigen Entwicklung des Kleinhirns durchgehend zu verfolgen, um die reife Form des Kleinhirns zu erreichen. Und da das Kleinhirn ein relativ einfaches System ist, haben wir die Hoffnung, tatsächlich die Moleküle und Entwicklungsvorgänge zu entschlüsseln, die für die Bildung des gesamten Kleinhirns verantwortlich sind. Ich halte dies nicht nur für wichtig im Bereich der genetischen Diagnostik beim Menschen und für die Forschung zur Kleinhirnentwicklung, sondern glaube auch, dass wir die Erkenntnisse über diese Mechanismen auf andere Bereiche des Gehirns übertragen können.

Das Kleinhirn ist eine relativ einfache Struktur, aber viele der Entwicklungsereignisse sind nicht ausschließlich auf das Kleinhirn beschränkt. Wir können das, was wir vom Kleinhirn gelernt haben, auf andere komplexere Regionen des zentralen Nervensystems wie die Großhirnrinde übertragen und anhand der erlernten Erkenntnisse und Signalwege herausfinden, wie diese auf den Rest des Gehirns anwendbar sind.