Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Dies ist ein Max-MIDI-Magnet. Darauf steht: Vorsicht, extrem starke Magnetfelder. Hallo, ich bin Melanie Matthew aus dem Labor von Mike Collins an der Abteilung für Physiologie und Biophysik der University of California Irvine.

Heute zeigen wir Ihnen die negativselektive Aufreinigung von CD4-positiven T-Zellen mithilfe der Kits von Milton Biotechnology. Hier haben wir den Minimax und die Minimax-Magnete. Der Minimax wird für größere Trennungen verwendet. Es können bis zu 10⁹ Zellen durch eine Säule geleitet werden, die in den Minimax passt. Der Minimax wird hingegen für deutlich geringere Zellvolumina verwendet.

Je nachdem, ob eine positive oder negative Trennung durchgeführt wird, markieren Sie Ihre Zellen mit dem entsprechenden Antikörper. Diese besitzen ein magnetisches Kügelchen, das an den Magneten bindet. Im Fall einer negativen Selektion fließen die Zellen, an denen Sie interessiert sind, durch die Säule, und Sie können den Eluat sammeln, der Ihre Zellen von Interesse enthält.

Ich sollte erwähnen, dass die Techniken, die ich Ihnen heute Abend zeige, nicht steril sind. Wenn Sie diese Zellen also für die Zellkultur verwenden möchten, sollten Sie alles unter der Gewebekulturhaube mit sterilen Instrumenten durchführen. Obwohl ich Ihnen hier eine Aufreinigung von CD4-positiven T-Zellen zeige, lassen sich viele dieser Techniken auch bei der Reinigung anderer Zelltypen mit den Miltenyi-Biotechnologie-Kits anwenden.

Okay, ich habe die Lymphknoten aus der Maus entfernt, und ich zeige Ihnen ausführlich, wie dies in Ausgabe sieben von JoVE zur Vorbereitung von Lymphknoten für die Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt wird. Nun werde ich die Lymphknoten in einem 70-Mikrometer-Zellfilter zu einer Einzelzell-Suspension zerkleinern. Okay, jetzt zerkleinere ich die Lymphknoten mithilfe des Kolbens einer sechs-Milliliter-Spritze zu einer Einzelzell-Suspension.

Die Lymphknoten befinden sich in RPMI innerhalb eines Filters, und es ist wichtig, eine geeignete Einzelzell-Suspension herzustellen. Der Grund dafür, dass wir dies in einem Filter tun, ist, dass sichergestellt werden soll, dass keine Zellklumpen vorhanden sind. Sobald ich das Zermahlen abgeschlossen habe, werde ich den Filter aus dem Medium nehmen und anschließend die Zellen verwenden, die durch das Sieb gegangen sind, sowie die Einzelzell-Suspension.

Wenn Sie mahlen, sollten Sie sicherstellen, dass Sie das gesamte Gewebe so stark wie möglich zerstören. Diese Einzelzell-Suspension ist die Quelle, aus der wir unsere CD4-positiven T-Zellen reinigen werden. Gut, ich habe das Mahlen des Gewebes abgeschlossen und Sie können sehen, dass die meisten Lymphknoten weitgehend verschwunden sind.

Wir haben hier noch einige kleine Fettanteile und gewissermaßen die Hülle eines Lymphknotens mit etwas Bindegewebe, das alles von den sechs Lymphknoten zusammenhängt. Nun entferne ich den Zellsieb. Und Sie können hier sehen, dass das Medium sehr trüb ist.

Es ist voller Zellen aus der Einzelzell-Suspension, um sicherzustellen, dass wir eine maximale Anzahl an Zellen aus dem Filter erhalten, wobei einige davon daran haften bleiben. Ich wasche es mit einigen Millilitern Medium und pipettiere anschließend das gesamte Medium in ein 15-ml-Falcon-Röhrchen, das ich zentrifugiere, um die Zellen später für die Reinigung zu pelletieren. Hier ist also meine Einzelzell-Suspension, zentrifugiert und pelletiert bei 300 × g für 10 Minuten.

Wenn Sie erwarten, dass sich in Ihrer Einzelzell-Suspension eine hohe Anzahl toter Zellen befindet, ist es ratsam, das Kit zur Entfernung toter Zellen von Miltenyi Biotec zu verwenden. Da ich die Probe nun pellettieren habe, werde ich das Medium abgießen und eine Lyse der roten Blutkörperchen durchführen. Anschließend werde ich die Zellen zählen und danach ein CD4-positives T-Zell-Negativselektionskit auf diese speziellen Zellen anwenden. Gut, jetzt führe ich die Erythrozytenlyse durch.

Wir werden die roten Blutkörperchen, die wir zusammen mit den Lymphozyten pelletiert haben, lysieren, indem wir die Osmolarität der Lösung verringern, indem wir zunächst Wasser hinzufügen und sie anschließend durch Zugabe von 10 X-D-B-P-S wieder auf eine 1x-Lösung bringen. Unsere Lymphozyten sind gegenüber der Änderung der Osmolarität resistenter als rote Blutkörperchen, aber wir müssen dennoch schnell arbeiten, da wir sonst auch unsere Lymphozyten lysieren würden, was wir nicht wollen. Ein Teil des schnellen Arbeitens besteht darin, dass ich die Volumina, die ich für die Lyse benötigen werde, bereits vor dem eigentlichen Hinzufügen von Wasser zum System auffülle.

Ich möchte mein 10×-D-B-P-S einige Sekunden, nachdem ich das Wasser hinzugegeben habe, hinzufügen, um sicherzustellen, dass ich meine Lymphozyten nicht lysiere und gleichzeitig die roten Blutkörperchen lysiere. Dazu nehme ich 900 Mikroliter Wasser und fast einhundert Mikroliter 10×-D-B-P-S.

Ich habe beide Pipetten bereit. Bei der Lyse gebe ich das Wasser hinzu, warte einige Sekunden, schüttele das Reagenzglas möglicherweise leicht und füge dann den 10×-D-B-P-S hinzu, anschließend schüttele ich das Reagenzglas etwas stärker. Und wenn Sie viele rote Blutkörperchen lysieren, werden Sie eine große, amorphe Ansammlung aus gebrochenen Zellmembranen entstehen sehen.

Wir haben hier eine kleine Menge davon, und Sie können sehen, dass es sich um etwas gebrochene Zellmembranen handelt. Nachdem ich die Lyse durchgeführt habe, füge ich gerne noch einige Milliliter Medium zu den Zellen hinzu, falls beim Pipettieren ein Fehler aufgetreten ist, um sicherzustellen, dass die Osmolarität korrekt ist und keine weitere Lyse stattfindet. Gut, nun habe ich meine Lymphozyten in einer Einzelzell-Suspension.

Auch hier habe ich die Lyse der roten Blutkörperchen durchgeführt und werde sie nun zentrifugieren, um sie zu pelletieren. Vorher werde ich sie mit dem Hämocytometer zählen, um zu bestimmen, wie viel Antikörper wir für das CD4-positive T-Zell-Negativselektionskit hinzufügen müssen. Gut, jetzt zentrifugiere ich die Zellen in Max-Puffer, und Sie können sehen, dass das Pellet nach der RBC-Lyse viel weißer ist.

Und ich werde eine negative Selektion für CD4-positive T-Zellen durchführen. Dazu gieße ich das gesamte Medium sowie den gesamten Max-Puffer, in dem ich die Zellen suspendiert habe, ab. Anschließend werde ich mit dem Biotin-Antikörper-Cocktail markieren, was Schritt eins der negativen Selektion für CD4-positive T-Zellen darstellt.

Dann inkubiere ich 10 Minuten im Kühlschrank. Gut, meine Zellen sind mit der ersten Inkubation fertig. Nun werde ich das Antibiotikum zu den Mikroperlen hinzufügen und sie für 15 Minuten wieder in den Kühlschrank stellen.

Für diese spezielle Zellseparation verwenden wir eine LS-Säule von Miltenyi Biotec und befestigen sie am magnetischen Halter. Die Säule wird vorbereitet, indem wir drei Milliliter MAX-Puffer hindurchlaufen lassen. Dazu öffnen wir die Säule und platzieren sie so, dass die Haltezungen nach innen in Richtung Magnet zeigen. Nun gebe ich den MAX-Puffer auf die Säule; Sie sollten sehen, wie der Puffer durch die LS-Säule läuft und am unteren Ende zu tropfen beginnt. Es ist nicht schlimm, wenn die Säule zwischendurch austrocknet.

Die Oberflächenspannung der Flüssigkeit verhindert, dass sie austrocknet, bis Sie Ihre Zellen hinzufügen. Bevor Sie die Zellen hinzufügen, ist es wichtig, den Max-Puffer vollständig durch die Säule ziehen zu lassen. Gut, nach der 15-minütigen Inkubation mit unseren anti-Biotin-Magnetkugeln, die an die Zellen und den Max-Puffer gebunden sind, werde ich den Puffer abgießen und die Zellen in einer für unsere Zellzahl geeigneten Puffermenge resuspendieren.

Sie müssen daher Ihr milli-kleines Protokoll dafür überprüfen. Anschließend werde ich die Probe auf die Säule auftragen, die wir gerade mit Max-Puffer gewaschen haben. Nun fügen wir die Zellsuspension zur Säule hinzu.

Und da dies eine Negativselektionssäule ist, werden wir die Zellen sammeln, die durchgeflossen sind, und diese sollten in diesem Fall ausschließlich CD4-positive T-Zellen sein. Nun werde ich die Säule mit 12 ml Max-Puffer waschen und erneut die Eluierfraktion sammeln, die nur CD4-positive T-Zellen enthalten sollte. Anschließend werde ich die CD4-positiven T-Zellen abzentrifugieren, resuspendieren und sie dann mit dem geeigneten Farbstoff markieren, den ich für die Tau-Bildgebung verwenden werde.

Ich werde außerdem eine kleine Probe der gereinigten Zellen entnehmen, sie mit Anti-CD-drei- und Anti-CD-vier-Antikörpern markieren und auf einem FACS-Gerät analysieren, um sicherzustellen, dass ich eine reine Population von CD-vier-positiven T-Zellen erhalten habe. Hier sehen Sie die Zellen, die wir gerade abzentrifugiert haben. Dies sollte eine Population reiner CD-drei-, CD-vier-positiver T-Zellen sein.

Ich habe Ihnen soeben die negative Selektion von CD4-positiven T-Zellen gezeigt. Mithilfe des Miltenyi Biotech-Kits werden wir diese Zellen adoptiv in eine Maus übertragen und für eines unserer eigenen T-Photon- und Maschinenexperimente verwenden. Viel Erfolg bei Ihren eigenen Experimenten.