NADH Fluoreszenz-Imaging von isolierten biventrikulären Arbeiten Kaninchenherzen

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Stoffwechsel zu untersuchen. Mithilfe der NADH-Bildgebung an einem funktionsfähigen Herzpräparat wird dies erreicht, indem zunächst das Kaninchenherz isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, alle vier Herzkammern erfolgreich zu kanülieren, um ein funktionierendes Herzmodell zu erhalten.

Der letzte Schritt besteht darin, die Bildgebungsgeräte einzurichten und NADH-Daten bei verschiedenen Stimulationsfrequenzen zu erfassen. Letztendlich können die Ergebnisse metabolische Veränderungen des Herzens durch die Bildgebung des fluoreszierenden NADH zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Langendorff-Retroperfusion liegt darin, dass das Herz in seinem physiologischen Zustand arbeitet, mit Fluss in normaler Richtung und mit dem Herzen, das seinen eigenen Druck für die koronare Perfusion bereitstellt.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Elektrophysiologie und der Mechanismen letaler Arrhythmien zu beantworten. Dies geschieht durch die Bereitstellung eines physiologischen Modells, um den Zusammenhang zwischen koronarer Durchblutung, Metabolismus und elektrischer Aktivität zu untersuchen. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Kanülierung der Gefäße und Herzkammern schwer zu erlernen ist.

Unsachgemäße Technik kann das Herz beschädigen und den weiteren Verlauf des Experiments gefährden. Vor Beginn eines Experiments spülen Sie alle Schläuche in den Kammern des Working-Heart-Systems mit gereinigtem Wasser aus und entfernen Sie anschließend das Wasser aus dem System, indem Sie die Pumpen laufen lassen. Fügen Sie Zellulose-Membranfilter in Reihe mit der LOR-Perfusionspumpe, der linken Herz-Perfusionspumpe und der rechten Herz-Perfusionspumpe hinzu.

Nachdem Sie Perfuse acht dem System hinzugefügt haben, führen Sie eine Zweipunktkalibrierung für jeden Drucksensor durch. Schalten Sie das beheizte, zirkulierende Wasserbad ein, das die wassergekühlten Schläuche und die Wärmetauscher erwärmt. Schalten Sie das Wasserbad ein, das verwendet wird, um Perfuse acht zu erhitzen.

Schalten Sie die Pumpen ein, die das PERFUSE Eight in einem geschlossenen Kreislauf zirkulieren lassen, und schalten Sie den Zirkulationstank ein, um das Perfuse Eight zu oxygenieren. Achten Sie darauf, dass der Mikrofaser-Oxygenator oder die Hämofilter 95 % Sauerstoff bei 80 Kilopascal an das Perfuse Eight abgeben. Stellen Sie schließlich sicher, dass die Wärmetauscher die Temperatur des zirkulierenden Perfuse Eight konstant halten.

Bei acht 37 Grad Celsius beginnen Sie die Herzexzision, indem Sie zunächst das Arbeitsherzsystem so einstellen, dass es bei konstantem Druck im LRF-Modus arbeitet. Stellen Sie den Druck des aortalen Blockes zwischen 50 und 60 ein, nachdem Sie ein Kaninchen sediert haben.

Spritzen Sie Pentobarbital und Heparin entweder in die Randvene des Ohres oder in die seitliche Saphenaven an der Innenseite des Hinterbeins. Sobald der Hase keinen Schmerzreflex mehr zeigt, öffnen Sie schnell die Brusthöhle. Schneiden Sie das Perikard, klemmen Sie die Aorta ab und entfernen Sie Herz und Lungen.

Die Lungen bleiben angeheftet, um die Isolierung der Lungenvenen zu erleichtern. Füllen Sie als Nächstes eine Spritze mit 60 Milliliter pro F acht und 200 Einheiten Heparin. Bringen Sie eine fünf Millimeter lange Kanüle an und kanülieren Sie die Aorta.

Befestigen Sie die Aorta mit Seidenlitzen der Stärke null am Kanül. Drücken Sie dann langsam die Spritze, um das Blut durch das Herz zu spülen. Richten Sie das Arbeits-Herz-System ein, indem Sie zuerst das Herz an den Aortenblock anschließen.

Nähern Sie sich dem Verbinder in einem schrägen Winkel und lassen Sie Perfuse acht bis zehn vorsichtig aus dem Verbinder in die Kanüle tropfen, während diese angebracht ist. Dies verhindert, dass Luft in die Aorta gelangt, und beugt so koronaren Embolien vor, während das Herz bei konstantem Druck perfundiert wird. L endorf-Modus.

Entfernen Sie das Fett- und Bindegewebe und lokalisieren Sie die folgenden Gefäße: untere und obere Hohlvene, Aortenvene, Lungenarterie und Lungenvenen. Danach ligieren Sie die obere Hohlvene.

Schneiden Sie die Lungenarterie direkt unterhalb der Stelle durch, an der sie sich in die rechte und linke Lungenarterie verzweigt. Die verbleibenden Gefäße sind die Lungenvenen. Fassen Sie diese zwischen Herz und Lunge zusammen und ligieren Sie sie alle mit einer Naht.

Das ist aus zwei Gründen entscheidend. Erstens gewährleistet das Abbinden der mit den Lungen verbundenen Gefäße, dass nach Abschluss der Kanülierung kein Austritt erfolgt. Zweitens ist es wichtig, beide Vena-cava-Gefäße für die spätere Kanülierung zu isolieren.

Entfernen Sie nun die Lungen. Schneiden Sie ein Loch passender Größe in die Ecke des linken atrialen Anhängsels und stellen Sie sicher, dass es reichlich mit Perfusat acht gefüllt ist. Befestigen Sie anschließend die Kanüle am Anhängsel, wobei die Kanüle vollständig mit Perfusat acht gefüllt sein muss.

Dann, während das Gewebe gehalten wird, die Kanüle an dem Anhängsel vernähen. Das Gewebe des linken Vorhofanhangs ist äußerst empfindlich und kann leicht einreißen. Daher ist es wichtig, den linken Vorhof beim ersten Versuch zu kanülieren, da es sonst möglicherweise nicht möglich sein wird.

Schalten Sie die Pumpe Nummer zwei ein, um den Fluss zum linken Vorhof bereitzustellen. Stellen Sie die Vorspannung während des gesamten Experiments zwischen zwei und sechs Tor ein. Der Druck muss möglicherweise angepasst werden.

Halten Sie es innerhalb von zwei Millimetern des Ziel-Drucks. Schalten Sie nun das Herz in den Arbeitsmodus, indem Sie Pumpe Nummer eins, die Langendorff-Pumpe, vorübergehend ausschalten. Verringern Sie den aortalen Druck auf 10 Tor und erhöhen Sie ihn dann langsam auf einen Wert zwischen 80 und 100 Tor.

Dadurch kann sich die Aortenklappe öffnen und genauso funktionieren wie unter normalen physiologischen Bedingungen. Stellen Sie den endgültigen Nachlastdruck auf einen Wert ein, der etwa 20 Tore unter dem systolischen Druck der linken Kammer liegt, und verwenden Sie hierzu eine Kanüle, die direkt am System angebracht ist.

Kanülieren Sie das rechte Vorhof über die untere Hohlvene CVA und nähen Sie die Kanüle an der Vene fest. Vermeiden Sie das Eindringen von Luftblasen. Schalten Sie Pumpe Nummer drei, die rechte Seitenpumpe, ein, um Durchfluss zum rechten Vorhof bereitzustellen.

Stellen Sie den Druck auf etwa drei Torr ein. Schließen Sie schließlich den rechten Ventrikel an, ohne dass Luft eindringt, und nähen Sie die Kanüle an die Pulmonalarterie an. Damit ist die biventrikuläre Kanülierung abgeschlossen.

Nun fortfahren mit der Signalerfassung. Den Katheter des Druckmesswandlers vorsichtig über die Aortenkanüle in die Aorta einführen. Vorsichtig durch die Aortenklappe und in das linke Ventrikel (lv) vorantreiben.

Das LV-Drucksignal erscheint wie erwartet, wenn die Katheterspitze korrekt positioniert ist. Anschließend drücken Sie die monopolare Aktionspotentialelektrode vorsichtig gegen das ventrikuläre Epikard. Ein geringes Bewegungsartefakt im Elektroden-Signal ist normal.

Bringen Sie als Nächstes eine bipolare Stimulations-Elektrode am rechten Vorhof an, um das Herz gemäß der experimentellen Versuchsanordnung zu stimulieren. Richten Sie außerdem die CCD-Kamera auf den interessierenden Bereich des Herzens aus. An der Kamera sollte ein Emissionsfilter angebracht sein.

Um die NADH-Fluoreszenz zu überprüfen, schalten Sie die Umgebungsbeleuchtung aus, um das Epikard mit einer UV-Lichtquelle an der Arbeitsstation, an der die Kamera befestigt ist, gleichmäßig zu beleuchten. Stellen Sie die Software so ein, dass Bilder mit zwei Bildern pro Sekunde aufgenommen werden. Wählen Sie dann den Live-Update-Modus, um die mittlere Pixelintensität innerhalb des interessierenden Bereichs zu überwachen.

Wenn die Perfusion ausreichend war, sollten die durch die Fluoreszenz dargestellten NADH-Spiegel auf der epikardialen Oberfläche niedrig und stabil sein. Führen Sie nun das Experiment durch, sobald es abgeschlossen ist. Entfernen Sie das Herz.

Spülen Sie die PERFUSE acht und die Systemschläuche sowie -kammern mit gereinigtem Wasser. Spülen Sie das System regelmäßig mit mukosaler TM-Lösung oder einer verdünnten Wasserstoffperoxid-Lösung gemäß dem beschriebenen Protokoll. Die Herzen wurden bei Zykluslängen zwischen 200 und 400 Schlägen pro Minute stimuliert.

Der diastolische LVP lag normalerweise zwischen null und 10 Tor, wobei der minimale diastolische aortale Druck bei etwa 60 Tor lag. Der maximale systolische LVP hängt von der Füllungsdruck und Kontraktilität ab und sollte optimalerweise zwischen 60 und 80 Tor liegen. Der maximale aortale Druck und der maximale LVP sollten gut übereinstimmen. Monophasische Aktionspotentiale, typisch für das Kaninchenherz, weisen eine schnelle Depolarisationsphase und eine charakteristische Repolarisationsphase auf. Aktionspotentiale konnten problemlos aus den Präparaten aufgezeichnet werden, wiesen jedoch gewöhnlich einen kleinen Bewegungsartefakt während der Diastole auf.

Die durchschnittlichen fluoreszierenden NADH-Werte aus einem interessierenden Bereich in der roten Box wurden gemessen, um Änderungen im mitochondrialen Redoxzustand während dreier Pacing-Zyklen mit Pulsationslängen von 300, 200 und 150 Millisekunden zu überwachen, wenn die Pulsfrequenz nahe am Sinusrhythmus lag. Der NADH-Grundniveauwert blieb relativ konstant, während die Zykluslänge verkürzt wurde. Unterhalb von 300 Millisekunden stiegen die NADH-Grundniveauwerte an, wobei die stärkste Zunahme bei 150 Millisekunden beobachtet wurde; das Signal oszilliert mit der Kontraktion, und die Oszillationsfrequenz entspricht der Herzfrequenz.

Die Amplitude dieser Oszillationen war stets geringer als alle längerfristigen Trends, die durch Ischämie oder Hypoxie verursacht wurden. Die hochauflösende fluoreszierende NADH-Bildgebung der gesamten vorderen Oberfläche bei 200 Schlägen pro Minute war konstant und räumlich homogen bei 400 Schlägen pro Minute. Die NADH-Spiegel stiegen im gesamten Epikard deutlich an.

Es wurde eine signifikante räumliche Heterogenität beobachtet, wobei die stärksten Zunahmen in den septalen Regionen des RV und LV auftraten, nachdem die Technik beherrscht wurde. Diese Technik kann in weniger als 45 Minuten durchgeführt werden, wenn sie korrekt ausgeführt wird. Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, daran zu denken, zu verhindern, dass Luftblasen in die Aorta oder das linke Vorhof eindringen, nachdem das Verfahren abgeschlossen ist.

Zusätzliche Methoden, wie die Beladung des Herzens mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff, können verwendet werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise den Zusammenhang zwischen elektrischer und metabolischer Aktivität an der Oberfläche des Herzens während pathologischer Szenarien wie lokaler Ischämie nach der Entwicklung. Diese Technik ebnete Forschern in der Herzphysiologie den Weg, Herzstoffwechsel und Leitungsstörungen während pathologischer Zustände anhand eines physiologisch relevanteren Modells zu untersuchen.