Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Diese Standardmethode erzeugt mit fluoreszenzmarkiertem Gelatin beschichtete Deckgläser, die für quantitative Assays zum Nachweis der Matrixdegradation durch Invadopodien geeignet sind. Nach der Beschichtung der Deckgläser mit fluoreszenzmarkiertem Gelatin werden die Zellen ausgesät und zur Matrixdegradation kultiviert. Anschließend fixieren und fluoreszenzmarkieren Sie die Zellen mit Markern für Invadopodien-Proteine, nehmen die Bilder auf und quantifizieren die Matrixdegradation.

Typische Ergebnisse können die Unterschiede bei der Podien-vermittelten Matrixdegradation zwischen Zellen mit unterschiedlicher Manipulation ausgewählter Gene oder Behandlung mit pharmakologischen Substanzen quantifizieren. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Herstellung von mit Gelatine beschichteten Deckgläsern mit homogener Fluoreszenz aufgrund ungleichmäßiger Beschichtung mit fluoreszierender Gelatine oder unsachgemäßer Handhabung der gelatinebeschichteten Deckgläser schwierig ist. Die Durchführung der Methode wird von der wissenschaftlichen Assistentin Professorin Karen Martin, dem Postdoktoranden Mandy Ammer sowie den Doktoranden Elise Walk, Karen Hayes und Steve Markwell demonstriert.

Zur Herstellung der unmarkierten 5 %igen Gelatine-Zuckers-Lösung Gelatine und Saccharose in PBS mischen und bei 37 Grad Celsius vollständig auflösen. Anschließend bei vier Grad Celsius lagern. Danach die Reinigung der Glasdeckenplättchen durchführen.

Verteilen Sie eine einzelne Deckglas in jedes Loch einer 24-Loch-Kunststoffkulturschale und geben Sie in jedes Loch 500 µL 20 % Salpetersäure, anschließend 30 Minuten inkubieren. Nach dem Entfernen der Salpetersäurelösung die Deckgläser dreimal mit entionisiertem Wasser waschen. Danach beschichten.

Jede Deckglas mit 500 Mikrolitern einer 50 Mikrogramm pro Milliliter Polylysin-Lösung versehen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Polylysin-Lösung entfernen und dreimal mit PBS waschen. Die Poly-L-Lysin-Beschichtung erleichtert eine gleichmäßige Beschichtung und Bindung des überlagernden markierten Gelatins. Die 24-Loch-Platten auf Eis stellen und jeweils 500 Mikroliter frisch zubereitete 0,5 %ige Glutaraldehydlösung hinzufügen.

Die Platten 15 Minuten lang gut auf Eis inkubieren. Drei Waschungen mit kaltem PBS durchführen und anschließend alle Reste von PBS abziehen, bevor die Gelatine-Beschichtung erfolgt. In der Zwischenzeit, während der Inkubation mit Glutaraldehyd, die Oregon Green 488-konjugierte Gelatine rekonstituieren.

Gemäß der Herstelleranleitung erwärmen Sie die markierte 5 %-Gelatine-Lösung und die unmarkierte 5 %-Gelatine-Saccharose-Grundlösung auf 37 °C. Verdünnen Sie anschließend 500 µL markierte Gelatine in vier Milliliter unmarkierter Gelatine. Pipettieren Sie 100 µL der verdünnten 488-Gelatine-Mischung auf jedes Deckglas.

Verwendung einer ausreichenden Menge Gelatine, um den Deckglasobjektträger zu beschichten, ohne manuelles Verteilen. Es ist wichtig, die verdünnte Gelatine-Mischung mit 4 88 während des Beschichtungsvorgangs bei 37 Grad zu halten, um eine vorzeitige Verfestigung zu verhindern. Außerdem sollten die Deckglasobjektträger ab diesem Schritt so viel wie möglich im Dunkeln aufbewahrt werden, um eine mögliche Photobleiche zu vermeiden.

Wenn alle Deckgläser in einer Platte beschichtet sind, halten Sie die Platte schräg und entfernen Sie das überschüssige Gelatin aus jedem Well durch Vakuum-Aspiration. Anschließend inkubieren Sie die beschichteten Deckgläser 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nachdem Sie die Deckgläser dreimal mit PBS gewaschen haben, geben Sie 500 Mikroliter Natriumborhydrid, Natriumborhydrid hinzu.

Hydrid ist sprudelnd, und kleine Bläschen werden auf und um jeden Deckel sichtbar sein. 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um verbleibendes Glutaraldehyd zu reduzieren und zu inaktivieren. Die Natriumborhydrid-Lösung durch Vakuumabsaugung mit einer schnellen, kreisförmigen Bewegung am Rand jedes Wells entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, keine schwimmenden Deckel aufzusaugen, die sich während der Natriumborhydrid-Behandlung vom Boden der Zellkulturplatte gelöst haben. Nach drei Spülgängen mit PBS die Deckel 30 Minuten bei Raumtemperatur in 70 % Ethanol inkubieren.

Unter Verwendung steriler Technik die Deckgläser mit den Platten in eine laminare Luftströmungs-Werkbank der Klasse II für B-Zell-Kulturen überführen und die Deckgläser dreimal mit steriler PBS mithilfe einer sterilen Nadel und Pinzette spülen. Die Deckgläser vorsichtig in eine leere Vertiefung einer neuen 24-Loch-Platte übertragen, um sie mit dem Kulturmedium für den jeweiligen Zelltyp zu äquilibrieren.

Impfen Sie die Zellen nach einer geeigneten Inkubationszeit nun direkt auf die Deckgläser auf. Verarbeiten Sie die Proben zur immunfluoreszenzmikroskopischen Bildgebung, um die Proben zu montieren. Geben Sie einen Tropfen ProLong Gold Anti-Fade oder ein ähnliches Reagenz auf einen Objektträger und positionieren Sie vorsichtig das umgekehrte Deckglas darauf; anschließend können die Bilder zur Analyse aufgenommen werden.

Diese Analyse liefert die normalisierte Fläche des Matrixabbaus relativ zur Fläche der Zellen oder zur Anzahl der Zellen. Sie ist nützlich zur Untersuchung gesamter mikroskopischer Gesichtsfelder, in denen mehrere Zellen vorhanden sind, die gemeinsam mit irna-Wachstumsfaktoren oder therapeutischen Wirkstoffen behandelt wurden. Für diese Analyse werden Bilder mit niedrigerer Vergrößerung aufgenommen, die ausreicht, um effizient Informationen über Zellpopulationen zu sammeln.

Öffnen Sie das Bild in ImageJ. Überprüfen Sie die Maßstabsinformationen und wählen Sie die Messungen aus. Wählen Sie die Fläche und beschränken Sie die Optionen auf den Schwellenwert. Berechnen Sie die degradierte Fläche mithilfe des fluoreszierenden Gelatinbildes, indem Sie den Hintergrundschwellenwert korrigieren, um eine ungleichmäßige Beleuchtung über die Gelatinschicht auszugleichen, und setzen Sie die oberen und unteren Pixelintensitätswerte des Bildes.

Bei nachfolgenden Bildern. Verwenden Sie die Schaltfläche „Setzen“ im Schwellwertfenster, um für alle Bilder denselben Schwellwert als objektives Kriterium zur Auswahl des Abbaubereichs festzulegen. Nutzen Sie die Funktion „Partikel analysieren“, um den Schwellwert in den Bereichen des Matrixabbaus zu messen.

Wählen Sie eine Partikelgröße größer als null, um Rauschen aus der Auswahl zu entfernen. Zeigen Sie Umrisse an, um interessierende Bereiche zu identifizieren. Aktivieren Sie dann „Ergebnisse anzeigen“ und „Zusammenfassen“, um Messungen anzuzeigen, falls alle Bereiche der Degradation spezifisch umrissen wurden.

Kopieren Sie die Gesamtflächenmessung in eine Tabellenkalkulation, falls andere Objekte ausgewählt wurden, wie beispielsweise Schmutzpartikel; erfassen Sie nur die Flächen der relevanten interessierenden Bereiche. Öffnen Sie als Nächstes den Foid- und gefärbten Bildschwellenwert des Bildes, um die oberen und unteren Pixelintensitätswerte festzulegen, sodass die Zellränder in nachfolgenden Bildern ausgewählt werden. Verwenden Sie die Schaltfläche „Festlegen“ im Schwellenwert-Fenster, um denselben Schwellenwert für alle Bilder festzulegen.

Als objektives Mittel zur Auswahl des Zellbereichs. Nutzen Sie die Funktion „Partikel analysieren“, um den Schwellenwert für die Fläche der Zellen zu bestimmen. Wählen Sie eine Partikelgröße größer als null, um Störungen aus der Auswahl zu entfernen.

Umrisse anzeigen, um Bereiche für die Analyse zu identifizieren, Anzeigeergebnisse überprüfen und zusammenfassen, um Flächenmessungen anzuzeigen. Nicht aktivieren. Löcher einbeziehen, wenn Lücken zwischen Zellen und einem Verbund vorhanden sind.

Wählen Sie nun. Kopieren Sie die Flächenergebnisse für die relevanten interessierenden Bereiche in eine Tabellenkalkulation und berechnen Sie die Fläche der Gelatine-Degradation pro Gesamtzellfläche. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die degradierte Fläche auf die Zellanzahl zu normalisieren, die durch Zählen der mit DAPI gefärbten Kerne bestimmt wird.

Dies ist wichtig, wenn Manipulationen die durchschnittliche Zellfläche verändern. Verwenden Sie für diesen Ansatz das Kernzähler-Plugin, um Kerne automatisch zu zählen. Passen Sie die Optionen an, um eine Optimierung für Ihre Bilder zu erreichen. Wenn sich Kerne stark überlappen, kann die automatische Zählung möglicherweise keine genaue Aufzählung liefern. In diesem Fall.

Die manuelle Zählung kann mithilfe des Zellzähler-Plugins erleichtert werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Deckgläser werden gleichmäßig mit Oregon Green 488-markiertem Gelatin beschichtet. Bei der Beschichtung und Verarbeitung von mit Gelatin beschichteten Deckgläsern können mehrere Artefakte auftreten.

Zum Beispiel führt eine ungleichmäßige Beschichtung auf eine unsachgemäße Abdeckung des Deckgläschens während des Beschichtungsvorgangs zurück, verursacht durch unzureichendes Mischen, manuelles Verteilen oder teilweise Verfestigung der Gelatinemischung. Kratzer deuten auf eine Entfernung der beschichteten Matrix hin, die durch Anritzen mit Nadeln oder Pinzetten während der Handhabung entstehen. Eine Austrocknung der Oberfläche des Deckgläschens während längerer Lagerungszeiträume kann zu einem gepflasterten Erscheinungsbild führen. Dieser Bereich zeigt eine Fotoaufhellung der fluoreszierenden Gelatinoberfläche während der Bildaufnahme infolge verlängerter oder intensiver Lichtexposition.

Beachten Sie, wie ein gut präparierter Deckelobjektträger eine homogene Fluoreszenz zeigt, wenn er mittels Mikroskopie visualisiert wird. Die dabei entstehenden dünnen Matrizen bieten eine empfindliche Methode, um die Fähigkeit von Zellen zum Abbau der ECM zu bewerten. Zum Beispiel.

Diese Bilder zeigen die invasive Podium-Matrix-degradierende Aktivität einer OSC-19-Kopf- und Halskrebszelle. Die Zellen wurden auf einer mit Oregon Green 488 konjugierten Gelatine-Bedeckung ausgesät und mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, wie in 2D- und 3D-Bildern dargestellt. Diese OSC-19-Zellen, die auf mit Oregon Green 488 konjugierter Gelatine-Bedeckung ausgesät wurden, wurden mit R domine-konjugiertem Phalloidin und Anti-Cortactin-Antikörpern markiert, die mit dem sekundären Antikörper ANOR 647 sichtbar gemacht und grün pseudofärbt wurden.

Podien sind im überlagerten Bild als fokale zytoplasmatische Anreicherungen von F-Aktin und Cortan erkennbar, die sich mit Bereichen des Gelatine-Abbaus überlappen. Die Visualisierung zeigt, wie die invadierten Podien in das ECM-Subvolumen eindringen; dieses wurde erstellt, um eine Kante innerhalb der Zelle darzustellen, an der sich invadierte Podien befinden. Die Ansicht der dorsalen Kante verdeutlicht, wie invadierte Podien in die darunterliegende Gelatine eingefügt sind.

Die Ansicht von der Ventralseite zeigt Vorstülpungen in Veda-Podien und Bereiche des Gelatine-Abbaus unterhalb des Deckglases als rote Regionen vor grünem Hintergrund. Diese Bilder zeigen einige der wichtigen Schritte zur Quantifizierung des normalisierten Gelatine-Matrix-Abbaus von Zellen innerhalb eines gesamten mikroskopischen Bildes. Alle Fluoreszenzbilder wurden zur besseren Darstellung der roten Schwellenwerte und der Markierungen des Interessenbereichs in Graustufen umgewandelt.

Dieses Bild von Oregon Green 488-konjugiertem Gelatin zeigt die dunklen Bereiche, in denen ein Abbau stattgefunden hat. Durch Schwellenwertanalyse wird im Gelatinbild der Abbau hervorgehoben, und ausgewählte Regionen von Interesse werden hinsichtlich ihres Abbauumfangs vermessen. Auf diesem Bild ist, wie erwartet, Rumin, Foid und die Färbung von F-Aktin zu sehen.

Die Schwelle beim Aktin-Bild hebt die gesamte Zellfläche hervor, aus der die zu messenden Zellbereiche ausgewählt werden. Ebenso kann die Technik zur Analyse von Bildern von mit DAPI gefärbten Zellkernen angewandt werden. Dieses Panel zeigt ausgewählte Schritte zur Quantifizierung des fluoreszenten Gelatine-Abbaus durch einzelne Zellen innerhalb einer gemischten zellulären Population.

Diese einfache Quantifizierung bezieht sich auf eine einzelne transfizierte OSC-19-Zelle, die rekombinantes Cortactin überexprimiert, das an den Flag-Epitop-Tag fusioniert ist. Beachten Sie, wie die Matrixdegradation durch transfizierte Zellen auch innerhalb einer gemischten Population aus transfizierten und nicht transfizierten Zellen analysiert werden kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mehrere Dinge zu beachten.

Zunächst sollte sichergestellt werden, dass Ihre fluoreszierenden Zellmarker nicht mit der Farbe des fluoreszierenden Gelatins überlappen. Bei der Bildaufnahme ist es wichtig, Aufnahmefelder basierend auf dem Vorhandensein von Zellen auszuwählen. Vermeiden Sie eine gezielte Suche nach Bereichen mit Degradation, da dies die Daten aufgrund der Variabilität zwischen Zelllinien und deren Reaktionen auf verschiedene therapeutische Wirkstoffe verzerren könnte.

Faktoren wie die Abbaudauer der Beschichtungszahl und die Auswahl des Proteins für die immunfluoreszenzmarkierte Färbung sollten für Ihr spezielles Experiment optimiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Deckgläser herstellt, die gleichmäßig mit fluoreszierendem Gelatin beschichtet sind, um Beta-Podia-vermittelte Abbaunachweise durchzuführen, sowie Methoden zur Quantifizierung des Matrixabbaus.