Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Das Ziel dieses Videos ist es, ein Verfahren zur Charakterisierung des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs zu beschreiben. Schwache Öffnung in Mitochondrien, isoliert aus Mausherz. Zunächst werden Mitochondrien aus Mäuseherzen isoliert.

Mit der Methode der differenziellen Zentrifugation wird anschließend die Qualität der isolierten Mitochondrien mithilfe einer an einen Computer angeschlossenen Sauerstoffelektrode bewertet, um das Atmungskontrollverhältnis zu messen und die Integrität der mitochondrialen Membran zu beurteilen. Anschließend erfolgt mittels spektrofluorometrischer Geräte die gleichzeitige Messung des Kalziumhaushalts, des mitochondrialen Membranpotentials und des mitochondrialen Volumens, um den Permeabilitätsübergang zu bestimmen. Schlechte Öffnung.

Die resultierenden Daten zeigten Unterschiede in der Kalzium-Retentionskapazität und der mitochondrialen Permeabilitätstransition. Geringe Empfindlichkeit isolierter Mitochondrien, Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätstransition. Die Pore ist ein komplexes Phänomen, das Veränderungen auf mehreren Ebenen der mitochondrialen Physiologie und Anatomie beinhaltet.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die gleichzeitige Messung mehrerer Parameter ein umfassenderes Bild des Phänomens bietet als die alleinige Messung einzelner Parameter wie Calcium, Mobilisierung oder Schwellung. Vor Beginn des Verfahrens den Isolationspuffer für Mitochondrien auftauen und den pH-Wert überprüfen, der 7,4 betragen sollte. Anschließend alle Puffer, Schalen und Röhrchen, die verwendet werden, auf Eis stellen. Beachten Sie, dass alle Schritte des Protokolls zur Mitochondrienisolation auf Eis durchgeführt werden müssen.

Legen Sie die Herzen euthanisierter Mäuse auf eine Petrischale und spülen Sie mit kaltem Puffer für die Isolierung von Mitochondrien das Blut ab. Übertragen Sie die Herzen anschließend mit einem Skalpell auf eine neue Petrischale, entfernen Sie Fett- und Vorhofgewebe und zerkleinern Sie das Herzgewebe, bis ein homogenes Produkt vorliegt.

Überführen Sie die zerkleinerten Herzen in eine 50-Milliliter-Kegelrohrflasche. Geben Sie 10 Milliliter Mitochondrien-Isolierpuffer mit 0,1 Milligramm pro Milliliter Trypsin hinzu und lassen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis verdauen. Beachten Sie, dass die Verwendung von Trypsin die Ausbeute an isolierten Mitochondrien erhöht und zwischen verschiedenen Mitochondrienpräparationen konstant gehalten werden sollte.

Es wird jedoch empfohlen, die Funktionalität der isolierten Mitochondrien an Präparationen zu überprüfen, die in Abwesenheit von Trypsin gewonnen wurden, um sicherzustellen, dass das Enzym ihre Ionen nicht beeinträchtigt. Nach der Inkubation 10 Milliliter Mitochondrien-Isolationspuffer mit 0,1 % fettfreiem BS, a, und fünf Milligramm Trypsininhibitor hinzufügen und durch mehrmaliges Vorsichtiges Umstülpen des Probengefäßes mischen, um den Trypsin zu neutralisieren. Das digestierte Gewebe durch Zentrifugation bei niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit für eine Minute bei vier Grad Celsius gewinnen.

Nach dem erneuten Vortexen suspendieren Sie das Gewebe in acht Milliliter Isolierungspuffer für Mitochondrien mit 0,1 % fettfreiem BSA und lagern die Probe auf Eis. Homogenisieren Sie die Probe mit einem motorisierten Dounce-Homogenisator und einem Teflon-Stößel durch vier bis sechs Durchgänge bei 1.200 bis 1.400 U/min. Überführen Sie das Homogenat in eine 15-Milliliter-Konikalflasche und zentrifugieren Sie es bei 800 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Um die Kerne und Gewebetrümmer zu pelletieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand, der die Mitochondrien enthält, in Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 8.000 × g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation weist das Pellet eine weiße Schicht an der Oberseite auf.

Entfernen Sie vorsichtig mithilfe eines Vakuumsystems die weiße Schicht auf dem mitochondrialen Pellet. Resuspendieren Sie anschließend das verbleibende dunklere Pellet, das die Mitochondrien enthält, in einem Milliliter Mitochondrien-Isolierpuffer.

Zentrifugieren Sie anschließend die Mitochondrien bei 8.000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet in 150 Mikroliter Mitochondrien-Isolierpuffer. Bewahren Sie die Mitochondrien auf Eis auf.

Die Atmung isolierter Mitochondrien wird mit einer an einen Computer angeschlossenen und über die Oxy-Software gesteuerten thermischen Sauerstoffelektrode gemessen. Die Sauerstoffelektrode sollte am Tag des Experiments kalibriert werden. Geben Sie zwei Milliliter Mitochondrien-Atmungspuffer, der eine Endkonzentration von einem Mikromolar Rotenon enthält, in die Oxy-Kammer, verschließen Sie die Kammer und beginnen Sie mit der Aufzeichnung des Sauerstoffsignals.

Das vom System aufgezeichnete Signal, das auf dem Computerbildschirm angezeigt wird, ist proportional zur Sauerstoffkonzentration in der Oxy-Therm-Kammer. Sobald das Sauerstoffsignal stabil ist, geben Sie 250 Mikrogramm Mitochondrien hinzu und registrieren Sie die basale Atmung für eine Minute. Die Atmung sollte an diesem Punkt sehr niedrig sein, da die Mitochondrien endogene Substrate veratmen.

Dies ist die Atmung im Zustand eins. Geben Sie Succinat in eine Endkonzentration von fünf Millimolar hinzu, um die mitochondriale Atmung am Komplex zwei einzuleiten, und nehmen Sie das Signal eine Minute lang auf. Der Sauerstoffverbrauch sollte während der Atmung im Zustand zwei ansteigen.

Um die Zustandsatmung auszulösen, geben Sie einen DP zu einer Endkonzentration von 150 µM hinzu. Zu diesem Zeitpunkt sollte der Sauerstoffverbrauch aufgrund einer TP-Synthese über die oxidative Phosphorylierung ansteigen. Registrieren Sie das Signal, bis die Atmung langsamer wird, was auf den Verbrauch von DP und den Übergang zur Atmung im Zustand vier hinweist.

Zustand vier, Atmung für mindestens eine Minute. Fügen Sie CCCP bis zu einer Endkonzentration von einem Mikromolar hinzu und registrieren Sie das Signal für eine Minute. An diesem Punkt sollte die entkoppelte Atmung maximal sein.

Berechnen Sie das Atmungssteuerungsverhältnis, indem Sie die Sauerstoffverbrauchsrate während des Zustands drei durch die Sauerstoffverbrauchsrate während des Zustands vier dividieren. Ein Ziel-RCR sollte größer als vier sein. Als Nächstes bewerten Sie die Integrität der mitochondrialen Membran, indem Sie in einer neuen Probe von Mitochondrien die Atmung im Zustand drei induzieren, indem Sie ADP auf eine Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen.

Zeichnen Sie dann den Sauerstoffverbrauch eine Minute lang auf, geben Sie 10 µM Cytochrom C hinzu und zeichnen Sie den Sauerstoffverbrauch zwei bis drei Minuten lang auf. Da Cytochrom C bei einer intakten mitochondrialen Präparation nicht in die mitochondrialen Membranen eindringen kann, wird kein Anstieg oder nur ein sehr geringer Anstieg der Atmung beobachtet. Ein Anstieg der Atmung weist auf beschädigte oder defekte mitochondriale Membranen hin.

Die Instrumentierung für die multiparametrische Messung des Öffnens des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs-Pores besteht aus einem Quantum-Master-Dual-Emissions-Spektrofluorimeter, das über das Felix-GX-Programm computergesteuert wird. Erstellen Sie mit dem Felix-GX-Programm ein Multidi-Aufnahmeprotokoll und geben Sie die Parameter zur Messung von Kalzium, mitochondrialem Membranpotenzial und Schwellung für die ratiometrischen Farbstoffe Forer und JC-1 ein, um die abgeleiteten Spuren für das Verhältnis und das JC-1-Verhältnis in einer Einweg-Vierseiten-Meth-ACRL-Vete zu erzeugen. Mischen Sie ein Milliliter Mitochondrien-Assaypuffer mit einer Endkonzentration von einem Mikromolar Rotenon, fünf Millimolar Succinat und 800 Nanomolar For a FF, geben Sie 250 Mikrogramm Mitochondrien hinzu und stellen Sie die Probe in das Probenfach des Spektralfluorimeters.

Beginnen Sie eine Minute später mit der Aufzeichnung der fluoreszierenden Signale, pausieren Sie die Aufnahme, geben Sie 500 Nanomolar JC-1 hinzu und starten Sie die Aufnahme dann erneut. Das JC-1-Verhältnissignal sollte ansteigen, was auf die Aufnahme durch aktive Mitochondrien hinweist. Setzen Sie die Aufzeichnung fort, bis das JC-1-Signal eine Plateauphase erreicht hat.

In der Regel innerhalb von fünf Minuten Calciumchlorid auf eine Endkonzentration von 20 µM zugeben. Ein sofortiger Anstieg des Fluor-FF-Verhältnissignals sollte sichtbar sein, der eine erhöhte Kalziumkonzentration im Assaypuffer anzeigt, gefolgt von einem allmählichen Abfall aufgrund des mitochondrialen Kalziumaufnahmes. Das JC-1-Verhältnissignal sollte eine kurzzeitige Abnahme zeigen, die auf eine leichte mitochondriale Membrandepolarisation hinweist.

Wenn das ER-FF-Verhältnissignal auf den Grundniveau zurückkehrt, was normalerweise innerhalb von einer bis 1,5 Minuten bei weiteren 20 Mikromolar Calciumchlorid der Fall ist, setzen Sie die Pulsung in festen Abständen fort, bis die Mitochondrien kein Calcium mehr akkumulieren können und mit der Freisetzung von Calcium in das Testpuffermedium beginnen. Das Öffnen des mitochondrialen Permeabilitätsübergangs-Pores wird durch einen gleichzeitigen Anstieg des URA-FF-Verhältnissignals infolge der Calciumfreisetzung sichtbar. Eine Abnahme des JC-1-Signalverhältnisses aufgrund des Kollapses des Membranpotentials und eine Abnahme der Lichtstreuung infolge mitochondrieller Schwellung, während sie aus C57BL/6J-Mäusen isoliert wurden.

Wie in diesem Video gezeigt, wurde der Sauerstoffverbrauch anschließend während der Atmung im Zustand drei in Gegenwart von Succinat und ADP sowie während der Atmung im Zustand vier nach dem Verbrauch von ADP gemessen. Wie hier dargestellt, erhöht die Zugabe von ADP den Sauerstoffverbrauch aufgrund der oxidativen Phosphorylierung, und der Sauerstoffverbrauch verlangsamt sich. Sobald der gesamte ADP verbraucht ist, wird die Reaktion isolierter Mitochondrien auf Entkopplung durch Zugabe von CCCP in Gegenwart von CCCP gemessen. Die Sauerstoffverbrauchsrate ist höher als während der Atmung im Zustand drei, um die Membranintegrität der isolierten Mitochondrien zu beurteilen.

Der Sauerstoffverbrauch wurde in Gegenwart von Succinat und einem DP sowie nach Zugabe von Cytochrom C gemessen. Wie hier zu sehen ist, erhöht die Zugabe von Cytochrom C den Sauerstoffverbrauch im Vergleich zu DP und Succinat nicht signifikant, was darauf hinweist, dass intakte mitochondriale Membranen für Cytochrom C undurchlässig sind. Um den mitochondrialen Permeabilitätsübergang zu bewerten, dient die Porenöffnung in isolierten Herzmitochondrien als Indikator für die mitochondriale Calcium-Retentionskapazität. Der mitochondriale Permeabilitätsübergang. Die Porenöffnung wurde durch schrittweise Zugaben von 20 µM ausgelöst.

Calciumchlorid, extramitochondriales Calcium und das Membranpotential wurden mit verhältnisbestimmenden Indikatoren gemessen. URA FF wird als grüne Kurve und JC-1 als rote Kurve dargestellt. Die Schwellung der Mitochondrien wurde durch Aufzeichnung der Lichtstreuung bei 525 Nanometern gemessen, die durch die schwarze Kurve angezeigt wird. Die Spezifität der JC-1- und Schwellungs-Signale wurde mit einem Mikromolar CCCP und fünf Mikrogramm pro Milliliter des mikrobiellen Toxins Ethin getestet. Wie hier zu sehen ist, geht die Calciumaufnahme durch Mitochondrien mit einer leichten Depolarisation der mitochondrialen Membran einher.

Nach vier Kalzium-Pulsen wird die Öffnung des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Pools als Anstieg der URA-FF, was Kalziumfreisetzung anzeigt, beobachtet. Eine Abnahme von JC-1 weist auf einen Kollaps des Membranpotentials hin und ein Anstieg des mitochondrialen Matrixvolumens, der als Verringerung der Lichtstreuung als Marker für Schwellung sichtbar wird, um die Spezifität der Öffnung des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Porens zu überprüfen. Dieselben Messungen wurden in Gegenwart von Cyclosporin A durchgeführt, das an die Komponente Cyclophilin D des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Por-Komplexes bindet. Wie in dieser Abbildung gezeigt, erhöht die Anwesenheit von einem Mikromolar Cyclosporin A die Anzahl der erforderlichen Calciumchlorid-Pulse, um das mitochondriale Permeabilitäts-Übergangs-Por im Vergleich zur Kontrollprobe zu öffnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Öffnung des mitochondrialen Permeabilitäts-Übergangs-Pores in isolierten Herzmitochondrien beurteilt werden kann. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, isolierte Mitochondrien von guter Qualität zu erhalten. Daher ist es wichtig, vor der Verwendung der Mitochondrien für weitere Experimente Kontrollmessungen zur Qualitätsprüfung durchzuführen.