Nanotopologie der Zelladhäsion auf Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Topologie der Zelladhäsion auf einem Substrat mit nanometrischer Präzision zu messen. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst auf transparenten Glasobjektträgern kultiviert und anschließend mit einem fluoreszierenden Marker inkubiert werden. Danach wird die Winkelposition des justierbaren Spiegels des Mikroskops kalibriert und die Position im Spiegelpositionierungsprogramm gespeichert.

Der nächste Schritt besteht darin, die Fluoreszenzbilder bei Bestrahlung unter etwa 10 verschiedenen Winkeln aufzuzeichnen. Der letzte Schritt ist die Berechnung der Zell-Substrat-Abstände mit einer Präzision von wenigen Nanometern. Abschließend werden die Ergebnisse zur Topologie der Zelladhäsion auf dem Substrat verwendet, um Unterschiede in der Adhäsion zwischen verschiedenen Zelllinien darzustellen, beispielsweise Krebszellen und weniger malignen Zellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konfokalen Mikroskopie liegt darin, dass die tatsächliche Auflösung im Bereich von nur wenigen Nanometern liegt. Obwohl diese Methode Einblicke in Zellmembranen ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme wie kleine Vesikel oder Nanomaterialien anwendbar.

Die Experimentdurchführung wird unsere Postdoktorandin Petra übernehmen, die die Zellproben vorbereitet, sowie unser Ingenieur Michael Wagner, der das Experiment durchführt. Um Zellen für die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie mit variabler Einfallswinkel vorzubereiten, säen Sie einzelne Zellen mit einer Dichte von 100 Zellen pro Quadratmillimeter auf einem Objektträger in Kulturmedium, das mit 10 % Fötales Kalbsserum und Antibiotika ergänzt ist. Kultivieren Sie die Zellen 72 Stunden lang in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.

Als Nächstes wird den Zellen der fluoreszierende Membranmarker 6-D-Decanoyl-2-Dimethylaminonaphthalen (Laurdan) in einer Konzentration von 8 µmol/L im Kulturmedium zugesetzt und 60 Minuten vor der Fluoreszenzmikroskopie inkubiert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, indem die Pufferlösung mit der Pipette über den Objektträger gegeben wird, um das Medium zu entfernen; anschließend wird die Pufferlösung von der Rückseite des Objektträgers abgewischt. Zur variablen Winkelmessung wird ein aufrechter Mikroskop wie ein Zeiss Axio Plan, ausgestattet mit einer rückseitig belichteten und/oder Exon E-M-CCD-Kamera, verwendet.

T-I-R-F-M ersetzt seinen Kondensor durch eine eigens angefertigte Beleuchtungseinrichtung mit einem halbzylindrischen Glasprisma, das optisch an die Objektträgerplatte gekoppelt ist. Der Laserstrahl fällt aus einer kollimierten Monomodefaser ein, die nach der Abbildung durch das Glasprisma und weitere optische Komponenten erneut einen parallelen Strahl an der Oberfläche der Probe erzeugt. Achten Sie darauf, dass der elektrische Feldvektor senkrecht zur Einfallsebene polarisiert ist.

Diese Position wird am Ausgangskoppler der Faser markiert. Verwenden Sie einen verstellbaren Spiegel, der sich im Kondensor befindet, in der Objektebene abgebildet wird und die Probe unter einem variablen Einfallswinkel oder Objektstrahlwinkel beleuchtet. Der verstellbare Spiegel kann von einem Schrittmotor angetrieben werden, der über eine Software gesteuert wird.

Jede Position entspricht einem genau definierten Einfallswinkel, der durch geometrische Messverfahren bestimmt wird. Zur Kalibrierung der winkelgenauen Position des verstellbaren Spiegels verwenden Sie einen fluoreszierenden Farbstoff wie einmillimolares Flavin-Nukleotid, gelöst in Wasser. Um den kritischen Winkel bei Variation des Einfallswinkels sichtbar zu machen, nutzen Sie den kritischen Winkel von 61,3 Grad für einen Glas-Wasser-Übergang als festen Wert; die Winkelposition des Spiegels, bei der der Einfallswinkel dem kritischen Winkel entspricht, wird im Spiegelpositionierungsprogramm gespeichert.

Stellen Sie mithilfe der Kamerasoftware die Parameter der E-M-C-C-D-Kamera ein, einschließlich Temperaturverstärkung, Aufnahmedauer und Shift-Geschwindigkeit. Verwenden Sie Immersionsöl, um den optischen Kontakt der Probe sicherzustellen. Wählen Sie mit einem Glasprisma ein Objektiv mit geeigneter Vergrößerung für die Zellen und einer mäßigen numerischen Apertur aus.

Um das Objekt im Mikroskop sichtbar zu machen, verwenden Sie einen geeigneten Langpass- oder Bandpassfilter zur Fluoreszenzerkennung. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder identischer Proben bei Variation des Beleuchtungswinkels auf. Die Einfallswinkel sollten gleich groß oder größer als der kritische Winkel sein.

Da der kritische Winkel für eine Zell-Glas-Grenzfläche 64,5 Grad beträgt, wird ein Winkelbereich von 66 bis 74 Grad mit Schritten von 0,5 oder einem Grad empfohlen. Zur Initiierung der Datenanalyse verwenden Sie das Lab-View-Programm, um die bei verschiedenen Winkeln aufgezeichneten Bilder sowie die Kameraeinstellungen, die Anregungswellenlänge und die Brechungsindizes auszulesen. Für Glas mit einem Brechungsindex von 1,52 und Zellen mit einem Brechungsindex von 1,37 werden die Einstellungen importiert, um eine korrekte Auswertung der Daten zu gewährleisten.

Für jeden Parametersatz werden die Eindringtiefe und der Transmissionsfaktor automatisch für den Erfolg des Verfahrens berechnet. Es ist wichtig, dass die Bilder sorgfältig aufgenommen und für die Analyse ausgewählt werden. Wählen Sie die zur Auswertung der Zell-Substrat-Abstände verwendeten Bilder gemäß der Gleichung aus.

Für einen Membranmarker können einzelne Bilder bei homogener Beleuchtung, wie in diesem Beispiel gezeigt, ausgeschlossen werden. Berechnen Sie Bilder der Zellsubstrat-Topographie und wählen Sie einen geeigneten Farbcode für die Anzeige während der Auswertung. Profile einzelner Bildpunkte können wie in dieser Abbildung dargestellt angezeigt werden.

Diese Profile können als Indikator für die Qualität der Anpassung verwendet werden. Speichern Sie abschließend das Evaluierungsprotokoll. Diese Abbildung zeigt Totalreflexionsbilder von U2 51 mg Glioblastomzellen mit einem aktivierten TP 53-Tumorsuppressorgen.

Nach Inkubation mit Luan, aufgezeichnet bei verschiedenen Einfallswinkeln, entsprechen 66 Grad einer Eindringtiefe des evaneszenten elektromagnetischen Feldes von etwa 140 Nanometern, 69 Grad einer Eindringtiefe von 75 Nanometern und 73 Grad einer Eindringtiefe von 60 Nanometern mit abnehmender Eindringtiefe. Die Fluoreszenz nimmt in der Intensität ab und stammt aus oberflächlicheren Zellbereichen, wie beispielsweise fokalen Kontakten an ihren Rändern. Die Abstände zwischen Zelle und Substrat werden in Panel D durch eine Farbcodierung dargestellt, die von null bis 600 Nanometern reicht, wie hier gezeigt.

Die Zell-Substrat-Abstände variieren stark über die Zellen hinweg, wobei nur wenige Nanometer durch Weiß bis Gelb und 250 bis 300 Nanometer durch Dunkelrot dargestellt werden. Dies weist darauf hin, dass fokale Kontakte und größere Zell-Substrat-Abstände in unmittelbarer Nähe zueinander liegen. Eine ähnliche Variation der Zell-Substrat-Abstände wird für U2-51-mg-Glioblastomzellen mit einem aktivierten Tumorsuppressorgen P 10 berechnet.

Im Gegensatz dazu sind die Zell-Substrat-Abstände für die U2 51 mg Kontrollzellen, dargestellt durch Gelb, und die Wildtyp-Zellen, dargestellt durch Orange bis Rot, nach ihrer Entwicklung eher konstant. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Zell-Substrat-Topologie, Tumorzellen und die morphologischen Veränderungen nach Lasertherapie zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Oberflächen mit einer tatsächlichen Auflösung im Nanometerbereich bei geringer Lichtexposition sichtbar gemacht werden können, was für lebende Organismen gut verträglich ist.