Small-scale Kernextrakten für funktionelle Assays von Gen-Expression Machineries

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Genexpression mithilfe funktioneller nukleärer Maschinerien zu analysieren, die aus Zellen isoliert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst die HeLa-Zellen geerntet und geschwollen. Danach werden die Zellen durch Abtöten lysiert und anschließend im dritten Schritt per Zentrifugation zur Pelletierung der Kerne verwendet.

Die Kerne werden durch Salzextraktion gewonnen, konzentriert und dialysiert, um lösliche und funktionelle Genexpressionssysteme zu erhalten. Letztendlich kann die Funktionalität der nukleären Extrakte anhand ihrer Transkriptions- und Spleißaktivitäten bewertet werden, die mit einem gekoppelten RNA-Polymerase-Transkriptions- und Spleißsystem bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie der Herstellung von Gesamtkernextrakten liegt darin, dass mit dieser Technik ein geringer Zellansatz zur Herstellung des Kernextrakts verwendet werden kann.

Beginnen Sie damit, HeLa-Zellen auf drei 150-Millimeter-Platten mit DMEM-Medium, das mit FBS und Antibiotika ergänzt ist, auszuplatzieren. Kultivieren Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂, bis die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen. Saugen Sie dann das Medium von den HeLa-Zellkulturen ab und waschen Sie die Zellen einmal mit jeweils 13 Milliliter PBS bei Raumtemperatur pro Platte. Anschließend wird das PBS abgesaugt, jede Platte wird kurz zur Seite gelegt, und der restliche PBS wird abgesaugt.

Verwenden Sie anschließend einen Zellabheber, um die Zellen an den unteren Rand jeder Platte zu schaben, und überführen Sie die Zellen in eine 1,5-Milliliter-Einweg-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen abschließend fünf Minuten lang bei 100 × g und 4 °C in einer Mikrozentrifuge. Entfernen Sie nun den PBS vorsichtig vom Zellpellet und schätzen Sie das gepackte Zellvolumen (PCV) anhand der Skalierung auf dem Röhrchen ab.

Dann geben Sie das doppelte Volumen an hypotonischem Puffer im Verhältnis zum PCV zum Zellpellet hinzu. Schütteln Sie das Gefäß vorsichtig, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Lösen Sie Zellaggregate gegebenenfalls vorsichtig auf, indem Sie die Zellsuspension mit einer 1000-Mikroliter-Pipette mehrmals auf- und abpipettieren.

Anschießend die Zellen unter denselben Zentrifugierbedingungen wie zuvor pelletieren. Nach der Zentrifugation vorsichtig die hypotone Pufferphase abpipettieren. Die Zellen haben sich bereits aufgeschwollen und das Zellvolumen hat sich auf etwa 750 bis 1000 Mikroliter vergrößert.

Fügen Sie frischen hypotonen Puffer in einem Endvolumen von 1,5 Milliliter hinzu und resuspendieren Sie die Zellen in diesem Puffer. Inkubieren Sie die resuspendierten, geschwollenen Zellen abschließend 10 Minuten lang auf Eis, während die Zellen abkühlen. Spülen Sie einen Dounce-Homogenisator mit hypotonem Puffer aus und stellen Sie ihn anschließend zusammen mit den Zellen auf Eis.

Danach den Stößel mit einem feinen Reinigungstuch, beispielsweise einem Kim-Tuch, abtrocknen. Mit einer 1000-Mikroliter-Mikro-Pipettenspitze mit verlängertem Schaft die Pufferlösung aus den Downs entfernen. Anschließend mit der Pipette die gekühlten, aufgequollenen Zellen in die Downs überführen.

Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist die Überprüfung der Lyse, um einen erfolgreichen Einstieg zu gewährleisten. Nach jedem Schritt am Mikroskop bewegen Sie langsam den engen Pistill fünfmal vorsichtig auf und ab, um die Zellen zu lysieren, und achten dabei darauf, Blasenbildung zu vermeiden. Übertragen Sie anschließend ein fünf Mikroliter großes Aliquot der lysierten Zellsuspension in ein Eppendorf-Röhrchen und geben Sie 10 Mikroliter Trypanblau sowie 15 Mikroliter 1× PBS hinzu.

Geben Sie die Zellsuspension auf einen Objektträger und untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop auf Lyse; die Kerne lysierter Zellen erscheinen nach drei Unzen blau. Die Lyse ist unzureichend, da zahlreiche lebende Zellen sichtbar sind. Nach fünf Unzen liegt eine ausreichende Lyse vor.

Überführen Sie die lysierten Zellen schließlich in eine vorab gekühlte Eppendorf-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang in einem Mikrozentrifugenröhrchen bei 1500 × g und 4 °C. Überführen Sie anschließend vorsichtig das Überstandsgemisch in ein neues Röhrchen, ohne den Zellpellet aufzuwirbeln. Schätzen Sie nun das pelletassoziierte nukleäre Volumen (PNV) ab, indem Sie die Einteilung am Röhrchen betrachten.

Füllen Sie die Spitze einer Mikropipette mit Puffer mit niedriger Salzkonzentration bis zur Hälfte des PNV. Danach führen Sie die Mikropipettenspitze in die Kerne am Boden des Einmalrohrs ein. Geben Sie den Puffer langsam in die Kerne, während Sie vorsichtig mischen.

Das Röhrchen vorsichtig anstoßen, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig resuspendiert ist. Danach Puffer mit hohem Salzgehalt in einer Menge von der Hälfte des PNV hinzufügen und das Röhrchen schnell einmal durch Umdrehen mischen. Das Röhrchen 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius rotieren lassen.

Zum Schluss die Kerne im Mikrozentrifugenröhrchen 15 Minuten bei 18.000 × g und 4 °C abzentrifugieren. Überführen Sie zunächst 500 µL des Überstandes in gekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das nukleäre Extrakt mit hohem Salzgehalt 15 Minuten bei 14.000 × g und 4 °C. Nach der Zentrifugation das Mini-Racon umdrehen und in ein neues einzelnes EOR-Röhrchen stellen.

Nach einer Zentrifugation für zwei Minuten bei 1000 × g und vier Grad Celsius wird der nukleäre Hochsalz-Extrakt auf etwa 115 Mikroliter konzentriert. Überführen Sie nun 45-Mikroliter-Aliquote des nukleären Hochsalz-Extrakts in Mini-Dialysekassetten (SLIs). Achten Sie darauf, dass die Unterseite des Objektträgers bündig mit der Unterseite des Schwimmkörpers abschließt.

Danach die SLIs in 500 Milliliter gekühlten Dialysepuffer geben. Abschließend die Aliquots eine bis zwei Stunden bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren; der nukleäre Extrakt erscheint nach der Dialyse trüb. Diese Abbildung zeigt repräsentative Daten, die eine gekoppelte RNA-Polymerase-II-Transkriptions- und Spleißreaktion in einem nukleären Extrakt im kleinen Maßstab mit einem nukleären Extrakt im größeren Maßstab vergleichen.

Wenn der A-C-M-V-D-N-A-Konstrukt in großen oder kleinen Kernextrakten inkubiert wurde, wurden ähnliche Mengen des neu gebildeten prä-mRNA zum Zeitpunkt fünf Minuten nach Zugabe von Alpha und Manin, um eine weitere Transkription zu blockieren, in beiden Extrakttypen synthetisiert. Die Spleißintermediate und Spleißprodukte reicherten sich im Zeitverlauf mit vergleichbaren Kinetiken in beiden Extrakttypen an. Diese repräsentativen Ergebnisse bestätigen, dass die Effizienz des gekoppelten Transkriptions- und Spleißsystems durch RNA-Polymerase II in großen und kleinen Kernextrakten ähnlich ist. Um die Nützlichkeit des kleinen Extraktformats zu demonstrieren, wurden Extrakte aus Hela-Zellen hergestellt, die entweder mit dem Spleißinhibitor E 7 1 0 7 oder mit der negativen Kontrollsubstanz Platy analy F behandelt worden waren, woraufhin ein gekoppelter Transkriptions- und Spleißassay durch RNA-Polymerase II wie in dieser Abbildung gezeigt durchgeführt wurde. Die Transkription durch RNA-Polymerase II erfolgte effizient in Extrakten, die aus sowohl Platy F- als auch E 7 1 0 7-behandelten Zellen gewonnen wurden.

Im Gegensatz dazu erfolgte die Spleißung normal in dem Extrakt, der aus den mit analytischem F behandelten Zellen hergestellt wurde, war jedoch in den mit E 7 1 0 7 behandelten Zellen abgeschafft. Diese Daten liefern den Beweis für das Konzept, kleine nukleäre Extrakte für die spezielle Behandlung von Zellen im kleinen Maßstab zu verwenden. Einmal beherrscht, kann diese Technik in weniger als fünf Stunden abgeschlossen werden.