Microdialysis Ethanol während operante Ethanol Selbstverwaltung und Ethanol Bestimmung durch Gaschromatographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Ethanolspiegel in Gehirndialysat während einer Sitzung der selbstverabreichenden Ethanolapplikation zu überwachen. Um dieses Maß mit synchronen Verhaltensweisen der Selbstapplikation zu vergleichen, wird dies erreicht, indem zunächst eine Mikrodialyse-Führungs- und Kanülenanordnung sowie ein Befestigungsbolzen chirurgisch implantiert werden und anschließend Ratten trainiert werden, Ethanol operant selbst zu verabreichen. Der zweite Schritt besteht darin, die Tiere an die Kopfhalterung mit dem Flexkabel zu gewöhnen, sodass diese während der Mikrodialyse die Ethanol-Selbstapplikation nicht beeinträchtigt.

Danach wird eine Mikrodialyse während einer Alkohol-Selbstapplikationssitzung durchgeführt, bei der ein Teil des Dialysats zur Alkoholanalyse vorbereitet wird. Anschließend werden die Dialysatproben hinsichtlich ihrer Ethanol-Konzentration mittels Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektion analysiert. Letztendlich zeigen die erhaltenen Ergebnisse den zeitlichen Verlauf des Alkohols, der während einer Alkohol-Selbstapplikationssitzung die untersuchte Hirnregion erreicht.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Punktion der Schwanz- oder Safenvene besteht darin, dass dieses Verfahren zum Zeitpunkt der Probenentnahme minimal invasiv ist und die Messung von Medikamentenkonzentrationen im Zeitverlauf in der gewünschten Hirnregion ermöglicht, während das Tier eine Verhaltensaufgabe ausführt. Personen, die neu in dieser Methode sind, werden in der Regel Schwierigkeiten haben, da sie eine Reihe spezialisierter Fähigkeiten erfordert, von denen viele nur durch wiederholte Übung oder praktische Erfahrung erworben werden können. Die Durchführung der Methode wird außerdem von Jeffrey Dilley, einem studentischen Hilfskraft in unserem Labor, demonstriert.

Alle gezeigten Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas genehmigt und entsprechen den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Für diese Verhaltens-Mikrodialyse-Experimente werden Ratten des Long-Evans-Typs verwendet, die an der University of Texas at Austin gehalten werden, über eine akkreditierte ALAC-Einrichtung verfügen und mit einer 21-Gauge-Kanüle über dem gewünschten Hirnareal chirurgisch implantiert wurden. Alle Tiere sollten mindestens eine Woche postoperative Pflege und Erholung erhalten und vor Beginn der folgenden Verfahren gesund sein.

Stellen Sie die Ratte in eine Operantenkammer von Med Associates, die mit einem lichterartigen versenkbaren Hebel und einem Tippgefäss ausgestattet ist, und trainieren Sie sie dazu, den Hebel zu betätigen, um Zugang zu einer 10%igen Saccharoslösung zu erhalten. Nachdem die Ratte darauf trainiert ist, auf die Saccharoslösung zu reagieren, beginnen Sie mit einem geeigneten Trainingsplan, bei dem über mehrere Trinkphasen hinweg in der Nacht vor der vorletzten operanten Sitzung schrittweise Ethanol in die Lösung gegeben wird. Nach der Anästhesie des Tieres und Überprüfung des Sedierungsniveaus befestigen Sie die Schlaufe der Feder an der Schraubhalterung am Kopfplatz der Ratte, um sie an die Vorrichtung zu gewöhnen, die aus einem Ausgleichshebel, Arm, drehbarem Schlauch, Feder und Ringständer besteht.

Lassen Sie die Ratte die Nacht über im operanten Versuchsraum in ihrem Heimkäfig mit freiem Zugang zu Futter und Wasser verbringen und führen Sie am nächsten Tag die Trainingssitzung mit dem Tether und der dazugehörigen Ausrüstung durch, und zwar am Tag vor dem Mikrodialyse-Experiment. Nach der Anästhesie der Ratte mit Isofluran überprüfen Sie die Sedierung durch einen Zehenquetschtest und setzen eine mit künstlichem zerebrospinalem Liquor perfundierte Mikrodialysesonde ein. Sichern Sie die Sonde ordnungsgemäß und stellen Sie anschließend die Flussrate der Sonde auf 0,2 µL pro Minute ein.

Stellen Sie die Ratte mit der gesamten Dialyseausrüstung in ihrem Heimkäfig im operanten Versuchsraum über Nacht unter Zugang zu Futter und Wasser. Am Tag nach dem Einsetzen der Sonde, mindestens zwei Stunden vor Versuchsbeginn, erhöhen Sie die Sonde auf ihre Arbeitsflussrate. Überprüfen Sie mithilfe einer Hamilton-Spritze, ob die Flussrate der Sonde konstant ist und mindestens 90 % der eingestellten Flussrate beträgt.

Wenn Neurotransmitter in den Dialysatproben untersucht werden sollen, entnehmen Sie Proben während aller Phasen des Experiments. Sammeln Sie zunächst Dialysatproben, während sich das Tier in seinem Heimkäfig befindet. Lagern Sie die Proben angemessen für eine spätere Analyse.

Überführen Sie die Ratte vorsichtig in die operante Kammer und starten Sie das Programm, das die Kammer steuert. Setzen Sie die Probenahme fort, während die Ratte wartet, bis der Hebel in die Kammer ausgefahren wird – nehmen Sie zwei Proben, bevor der Hebel ausgefahren wird. Beginnen Sie damit, einen Teil jeder Dialysatprobe für die Ethanol-Analyse zu sammeln, indem Sie ein geeignetes Aliquot Dialysat in ein zwei Milliliter fassendes Glasfläschchen pipettieren und das Fläschchen mit einer luftdichten Septumkappe verschließen; pipettieren und verschließen Sie die Ethanol-Proben schnell.

Da Ethanol flüchtig ist und das Probenvolumen gering ist, führt eine inkonsistente oder langsame Probenvorbereitung zu ungenauen Ergebnissen. Bewahren Sie den Rest für die Neurotransmitteranalyse auf. Die 20-minütige Trinkphase beginnt, nachdem das Med-Associates-Computerprogramm den Hebel in die Kammer ausgefahren hat und die Ratte ihn betätigt, um Zugang zu einer Flasche Trinklösung zu erhalten.

Nehmen Sie weiterhin Proben während des gesamten Trinkzeitraums; nach Beendigung des Trinkzeitraums zieht das Computerprogramm die Flasche aus der Kammer zurück. Halten Sie das Tier am Ende des Mikrodialyseexperiments für einen zusätzlichen 20-minütigen Post-Trinkzeitraum in der Kammer. Nach der Anästhesie der Ratte entfernen Sie die Sonde.

Wenn das Tier nicht unverzüglich human euthanasiert wird, ersetzen Sie den Obturator, um die Sichtbarmachung der Sondebahn sicherzustellen. Sammeln Sie das Gehirn innerhalb von drei Tagen nach dem Experiment. Analysieren Sie die Proben zusammen mit externen Ethanolstandards mittels eines Gaschromatographen mit Flammenionisationsdetektor, einem Headspace-Autosampler, der auf 50 Grad Celsius erhitzt wird, und einer Kapillarsäule mit Helium als mobile Phase.

Verwenden Sie eine Chromatographie-Workstation-Software, um das System für die Ethanol-Analyse vorzubereiten, und nehmen Sie die Aufzeichnung und Analyse der Chromatogramme vor. Heizen Sie die Probengabeplatte mit einem Umlaufwasserbad auf und öffnen Sie die Luft- und Wasserstoffflaschen. Starten Sie anschließend das Startprogramm.

Wenn es bereit ist, führen Sie eine 20-minütige Verbrennung durch, die die Faser desinfiziert. Stellen Sie Standardlösungen her, indem Sie 238 Mikroliter 95 %igem Ethanol in einem 100-Milliliter-Messkolben mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 Milliliter verdünnen. Erstellen Sie die Standardreihen durch eine serielle Verdünnung im Verhältnis eins zu eins.

Pipettieren Sie die Standards in Glasfläschchen und verschließen Sie diese genau wie die Proben. Achten Sie darauf, zusätzlich zu den Standards eine Wasserprobe (Leerprobe) mitzuführen. Geben Sie die Standards und Proben in das Probengeberfach des Autosamplers und erhitzen Sie sie, bis die gesamte flüssige Aliquot vollständig verdampft ist.

Um die Standards und Proben zu analysieren, erstellen Sie eine Probenliste, in der vermerkt ist, welche Probe sich in welchem Platz des Automatenprobengebers befindet, und notieren Sie, dass jede Probe angebohrt werden sollte. Leiten Sie anschließend die Datendateien in einen ausgewählten Ordner weiter, wählen Sie eine geeignete Methode für die Proben aus und starten Sie die Analyse. Nachdem das System alle Proben durchlaufen hat, überprüfen Sie, ob das Programm jeden Peak korrekt integriert hat.

Tragen Sie die Peakhöhe in Abhängigkeit von jedem bekannten externen Standard auf. Ethanol-Konzentration. Verwenden Sie die durch die Punkte gegebene lineare Funktion, um die Ethanol-Konzentration jeder Dialysatprobe zu interpolieren.

Diese Abbildung zeigt Beispiel-Chromatogramme für drei Konzentrationen von Ethanol-Standards sowie eines für eine Ratten-Dialysatprobe, die am Ende der Ethanol-Selbstapplikationssitzung gesammelt wurde. Die Ethanol-Peaks sollten relativ symmetrisch sein, konsistente Retentionszeiten aufweisen und ein Signal-Rausch-Verhältnis von mehr als 10 aufweisen. Wenn diese Kriterien nicht erfüllt sind, muss das System gewartet werden. Hochwertige Chromatographie und korrekte Standards ergeben eine lineare Eichkurve, mit deren Hilfe die Ethanol-Konzentration der Dialysatproben berechnet wird, die während der Selbstapplikationsphase von den Tieren gesammelt wurden.

Die ermittelten Ethanol-Konzentrationen im Dialysat sind nicht für die in-vivo-Probenrückgewinnung korrigiert und stellen nur einen Bruchteil der ethanolkonzentration im Gehirngewebe dar. Falls eine quantitative Mikrodialyse von Ethanol erforderlich ist, wird der Extraktionsanteil von Ethanol, der aus dem extrazellulären Raum in die Sonde diffundiert, experimentell bestimmt. Wenn man diese Methode einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in etwa vier bis fünf Stunden durchgeführt werden.

Das hängt von der Dauer der Verhaltenssitzung ab. Ein erfolgreicher Abschluss der Mikrodialysephase des Experiments hängt weitgehend von der Qualität der vorbereitenden Phasen ab. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass Ihre Ratten gut angefasst wurden und Sie sie an alle möglicherweise störenden Reize gewöhnt haben, die während des Dialyseexperiments auftreten könnten, damit das Selbstapplikationsverhalten der Tiere nicht beeinträchtigt wird.