Lensfree On-Chip-tomographischen Mikroskopie beschäftigt Multi-Angle-Beleuchtung und Super-Pixel-Auflösung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine linsenfreie, dreidimensionale Abbildung biologischer Proben über ein großes Bildgebungs­volumen auf einem Chip zu erreichen. Dies wird zunächst erreicht, indem die Probe direkt auf den Sensorchip platziert und eine teilweise kohärente Beleuchtung bereitgestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Lichtquelle lateral an verschiedene Positionen zu verschieben, um Aufnahmen durchzuführen.

Holografische Bilder der Probe mit verschobenen Subpixeln. Anschließend wurden die Subpixel verschoben. Holografische Bilder werden bei Vielfachen der Beleuchtung für die tomographische Bildgebung aufgezeichnet.

Der letzte Schritt ist die Datenverarbeitung, bei der der erfasste Datensatz digital rekonstruiert wird, um letztendlich dreidimensionale tomographische Bilder der Probe zu erhalten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen Lichtmikroskopie liegt darin, dass sie eine Hochdurchsatz-Bildgebung in einer kompakten Architektur ermöglicht. Dies macht unsere Plattform besonders nützlich für die Integration mit Lab-on-a-Chip-Plattformen.

In diesem Bericht wird der grundlegende Aufbau für eine Tischplatte-basierte Implementierung zur Tomographie statischer Proben beschrieben. Ein Monochromator mit einer Xenonlampe wurde so eingestellt, dass er eine Ausgangsleistung mit einer spektralen Breite von etwa einem bis zehn Nanometern um eine zentrale Wellenlänge von 450 bis 650 Nanometern liefert. Diese teilweise kohärente Ausgangsstrahlung wird anschließend in eine Multimode-Optikfaser eingekoppelt, um teilweise kohärentes Licht an das System zu übertragen.

Die optische Faser ist auf einer motorisierten Dreheinheit montiert, um den Beleuchtungswinkel zu verändern. Die motorisierte Einheit mit angebronnener Lichtquelle ist auf einer zweidimensionalen linearen XY-Bühne montiert, die verwendet wird, um in der Ebene Verschiebungen der Lichtquelle unter einem gegebenen Winkel zur Detektion zu erreichen. Ein A-C-M-O-S-Sensorarray mit fünf Megapixeln und einer Pixelgröße von 2,2 Mikrometern wird verwendet.

Der Detektor dient zur Aufnahme holographischer Bilder mit großem Sichtfeld der Proben. Es ist entscheidend, dass das Sensorarray in derselben axialen Ebene wie die Drehachse der Lichtquelle positioniert ist, um sicherzustellen, dass überprüft werden kann, ob der Sensor bei großen Beleuchtungswinkeln ausreichend Licht erhält. Während die linsenfreie optische Tomographie eine Vielzahl von Objekten wie Zellen und Mikroorganismen abbilden kann, werden die grundlegenden Prinzipien hier durch die dreidimensionale Mikroskopie einer Sea elgan-Probe unter Verwendung eines Skalpells oder einer Spatel demonstriert.

Nehmen Sie ein kleines Stück AGA aus der Petrischale, die die Kultur der Saugorganismen enthält. Ein kubisches Stück mit mehreren Millimetern Kantenlänge enthält Hunderte von Nematoden. Geben Sie das kleine Agarstück in ein Polypropylenröhrchen, das ein Milliliter entionisiertes Wasser enthält.

Vorsichtig 30 Sekunden bis eine Minute lang wirbeln. Nach 10 bis 15 Minuten sollte der Wurm aus dem Agar in das entionisierte Wasser hinauskriechen. Beachten Sie, dass die Würmer hier zu klein sind, um sie zu sehen, um die Würmer vorübergehend zu immobilisieren, und ein Milliliter fünf bis 10 Millimolar Lima.

Also Lösung ansetzen und 10 Minuten warten. Pipettieren Sie fünf bis 10 Mikroliter Probe vom Boden des Röhrchens und platzieren Sie sie zwischen zwei Deckgläser. Diese Probe, die eine große Anzahl vorübergehend immobilisierter Würmer enthält, kann zum Start der Datenaufnahme auf den Detektor gegeben werden.

Zu Demonstrationszwecken werden in diesem Abschnitt die Schritte zur Bildaufnahme für ein typisches linsenfreies optisches Tomographie- oder LOT-Experiment zusammengefasst. Der gesamte Prozess wurde jedoch durch die Verwendung einer benutzerdefinierten LabVIEW-Schnittstelle automatisiert. Um mit den manuellen Schritten zu beginnen, stellen Sie den Anfangswinkel des Drehstages auf minus 50 Grad ein, wobei null Grad der vertikalen Position der Lichtquelle entspricht. Stellen Sie die Anfangsposition des XY-Stages auf null null ein, was der Ausgangsposition entspricht.

Stellen Sie die Belichtungszeit des Detektors so ein, dass der dynamische Bereich optimal genutzt wird, wobei das Bild so hell wie möglich ist, ohne dass gesättigte Pixel auftreten, ohne dabei den Winkel des Drehstages zu verändern. Nehmen Sie neun Bilder für jedes Bild auf. Bewegen Sie den XY-Stage in eine neue Position auf einem 3-mal-3-Quadratgitter, sodass sich jedes Bild im Vergleich zum vorherigen um etwa ein Viertel eines Pixels verschiebt.

Die Aufnahme weiterer Bilder unter jedem Winkel könnte die Auflösung verbessern, abhängig von der Art des Objekts und dem Signal-Rausch-Verhältnis. Nachdem neun Bilder unter dem Ausgangswinkel aufgenommen wurden, justieren Sie die Position des XY-Objekttisches zurück auf die Null-Null-Position. Danach erhöhen Sie den Winkel des Drehobjekttisches in Schritten von zwei Grad, bis Sie +50 Grad erreichen.

Wiederholen Sie nach jedem Inkrement bei jedem neuen Winkel die beschriebenen Schritte. Die Winkelinkremente können je nach Optimierung der Aufnahmezeit im Verhältnis zur Bildauflösung feiner oder gröber gewählt werden. Nach der Datenaufnahme wird ein Satz von 459 Bildern erfasst, der neun um Unterpixel verschobene Bilder für jede der 51 verschiedenen Beleuchtungswinkel enthält.

Jedes Set aus neun Bildern wird digital mithilfe von Pixel-Super-Resolution-Algorithmen verarbeitet, um eine hochauflösende Projektion zu erhalten. Anschließend werden die Hologramme pro Winkel mit Super-Resolution verarbeitet, um 51 Projektionsbilder zu rekonstruieren. Die Datenverarbeitung wird hier mithilfe eines Laptops gezeigt.

Die Rekonstruktion würde unter Verwendung von Grafikprozessoren weniger als eine Sekunde für das gesamte Sichtfeld benötigen. Dieser Satz aus 51 Projektionsbildern wird anschließend mit dem Tom-OJA-Plugin zurückprojiziert. Für ImageJ werden die Projektionsbilder zunächst in ImageJ geladen, woraufhin das Tom-OJ-Plugin aufgerufen wird.

Eine Nachschlagetabelle, die den Betrachtungswinkel für jedes Projektionsbild bereitstellt, wird in OJ geladen. Mithilfe der gewichteten Rückprojektionsmethode können dreidimensionale tomographische Bilder der Probe gewonnen werden. Der große Sichtfeldbereich der linsenfreien optischen Tomographie wird hier demonstriert, da die Probe direkt auf dem Detektorarray platziert ist. Holographische Bilder der Objekte können über ein Sichtfeld von 24 Quadratmillimetern aufgezeichnet werden, das sich durch neuartige Detektorarrays mit größeren aktiven Flächen weiter vergrößern lässt.

Obwohl die Pixelgröße des Detektorarrays die Auflösung der aufgezeichneten holographischen Bilder begrenzt, verringern Techniken zur Pixel-Überauflösung dieses Problem. Hier sind Pixel-überauflöste Hologramme zusammen mit den rekonstruierten Projektionsbildern dargestellt, die eine räumliche Auflösung im Submikrometerbereich für drei verschiedene Beleuchtungswinkel bieten. Die Projektionsbilder können mithilfe tomographischer Bildrekonstruktionsverfahren kombiniert werden, um TOM-Grundlagen der Probe zu berechnen. Drei Schnittbilder in der XY-Ebene durch das vordere Ende des Wurms sind hier gezeigt, wobei die Pharynxtube, wie erwartet bei dieser annähernd zylindrischen Struktur mit einem äußeren Durchmesser von etwa fünf Mikrometern, nur im Schnitt bei Z gleich acht Mikrometern sichtbar ist.

Außerdem zeigt das Querschnittsbild in der XZ-Ebene deutlich die Grenzen des Wurms und des darin befindlichen Pharynxtubus, was eine erfolgreiche 3D-Bildgebung des Pharynx demonstriert. Durch seine Weiterentwicklung kann diese Technik Forschern den Weg ebnen, dreidimensionale Mikroskopie über Bildgebungsvolumina von mehreren Zentimetern Durchmesser durchzuführen. Daher kann die linsenfreie optische Tomographie ein nützliches Werkzeug für Hochdurchsatz-Bildgebungsanwendungen in Lab-on-a-Chip-Plattformen sein.