Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die zelluläre Motilität mithilfe eines auf Gold-Nanopartikeln basierenden Zellmotilitätsassays quantitativ über die Zeit hinweg messen zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst Glasdeckgläser für eine Beschichtung mit Gold-Nanopartikeln vorbereitet werden. Konkret werden endotoxinfreie Deckgläser mit Gelatine beschichtet und anschließend ausgebacken.

Der zweite Schritt besteht darin, Chloraursäure zu reduzieren, wodurch Goldnanopartikel entstehen, und die mit Gelatine beschichteten Deckgläser gleichmäßig mit der Lösung zu überziehen. Anschließend werden die Zellen für den gewünschten Zeitraum des Experiments auf die mit Goldnanopartikeln beschichteten Deckgläser gegeben. Danach verdrängt die Gelatine die Goldnanopartikel und erzeugt Spuren.

Der letzte Schritt besteht in der Überwachung und Quantifizierung der Zellmotilität mithilfe der Mikroskopie, um die von den wandernden Zellen erzeugten Spuren abzubilden. Letztendlich werden Flächenmessungen der Spuren mit frei verfügbarer Software durchgeführt. Einer der Hauptvorteile dieser Technik gegenüber etablierten Methoden, wie der Zeitrafferaufnahme, ist, dass dieser Test lediglich ein Standard-Lichtmikroskop und eine Standardkamera erfordert und frei verfügbare Bildgebungssoftware verwendet.

Außerdem ermöglicht der Assay einfach die Analyse und den Vergleich mehrerer Proben mithilfe eines auf Hochdurchsatz-Screening ausgerichteten Verfahrens. Obwohl diese Methode Einblicke in den Einfluss unterschiedlicher physiologischer Faktoren und der Zellbewegung ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise Untersuchungen zu den Auswirkungen von Pathogenen auf die Motilität infizierter Zellen. Im Allgemeinen können Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Methode vorschreibt, die im Protokoll angegebenen Volumina und Temperaturen streng einzuhalten.

In diesem Protokoll liegt der Schwerpunkt auf der Beurteilung der Farbe der Endlösung der ausgefällten Goldnanopartikel, um den Erfolg sicherzustellen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte des FGO-Kinetic-Track-Motilitätsassays schwer zu erlernen sind.

Sie enthalten mehrere Verfahren, die in Zell- und Molekularbiologielabors nicht üblich sind. Um Gelatine-beschichtete Deckgläser herzustellen, resuspendieren Sie zunächst die Gelatine in deionisiertem Wasser, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von 0,5 Gramm pro 300 Milliliter zu erhalten, und autoklavieren Sie danach das Gemisch 15 bis 30 Minuten lang. Dies sollte innerhalb von zwei Stunden nach dem Hinzufügen der Gelatine in einer Zellkulturwerkbank erfolgen.

Bereiten Sie die Deckgläser zur Beschichtung vor, indem Sie acht bis neun mit Säure gewaschene Deckgläser in eine 100 Millimeter große Plastikschale überführen. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser sich nicht berühren und auch nicht die Schalenwände berühren. Pipettieren Sie vorsichtig zwei bis drei Tropfen Gelatine auf jedes Deckglas, wobei ein Überlaufen auf die Schale vermieden werden sollte.

Danach stellen Sie die Schale mit den mit Gelatine beschichteten Deckgläsern in einen Ofen und backen sie bei 90 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach 10 Minuten nehmen Sie die Schale aus dem Ofen und stellen sie zurück in den Gewebe-Kultivierungshood.

Pipettieren Sie vorsichtig überschüssiges Gelatin ab. Stellen Sie die Schale zurück in den Ofen und trocknen Sie die Deckgläser bei 70 Grad Celsius für 45 Minuten. Sobald die Deckgläser trocken sind, nehmen Sie die Schale aus dem Ofen und bringen Sie sie zurück in die Zellkulturhaube.

Mit einer sterilen Nadel vorsichtig eine Seite der Deckfolie anheben. Anschließend mit sterilen Pinzetten die mit Gelatine beschichteten Deckfolien aus der Schale entfernen und in separate Vertiefungen einer 24-Loch-Platte geben. Der nächste Schritt besteht darin, deckfolien vorzubereiten, die mit kolloidalem Gold beschichtet sind.

Beginnen Sie mit der Herstellung von 10 Milliliter 0,5 %iger Natriumcitrat-Lösung, indem Sie in einer Zellkulturwerkbank 1,5 Milliliter der 14,5 Millimolar-Chloro-ORIC-Säure-Lösung und 13,5 Milliliter autoklaviertes, deionisiertes Wasser in einem sterilen, endotoxinfreien Erlenmeyerkolben kombinieren. Für jeweils acht bis neun Deckgläser sollte das Ergebnis eine leicht gelbliche Lösung sein. Chloro-ORIC-Säure ist toxisch und sollte sorgfältig gehandhabt werden. Zudem ist sie lichtempfindlich, weshalb der Kochschritt unter geringer Lichtintensität durchgeführt werden sollte.

Wenn die Lösung ihren Siedepunkt erreicht hat, nehmen Sie den Kolben von der Heizplatte und übertragen Sie ihn auf eine Rührplatte. Um die kolloidalen Goldpartikel in der Lösung zu bilden, geben Sie 0,7 Milliliter der 0,5%-igen Natriumcitrat-Lösung pro 15 Milliliter der Chloraursäure-Lösung unter Rühren hinzu und rühren Sie anschließend etwa zwei Minuten weiter. Während dieser Zeit verändert sich die Farbe der Lösung von einem blassen Gelb über klar und grau bis hin zu lila und schließlich tiefviolett.

Bevor die Lösung endgültig eine rotwein- oder besser rostfarbene Färbung erreicht, saugen Sie die kolloidale Goldlösung in eine 10-Milliliter-Pipette auf und lassen Sie die Lösung in der Pipette eine bis zwei Minuten lang abkühlen, bis sie Raumtemperatur erreicht hat. Geben Sie dann 0,5 bis 1 Milliliter auf die mit Gelatine beschichteten Deckgläser in der 24-Loch-Platte. Stellen Sie die 24-Loch-Platte mit den mit kolloidalem Gold beschichteten Deckgläsern in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie 30 Minuten lang. Nachdem die Partikel Zeit hatten, sich auf den mit Gelatine beschichteten Deckgläsern abzusetzen, überprüfen Sie ihre Dichte unter einem Lichtmikroskop.

Die geeignete Verteilung von Goldnanopartikeln trägt dazu bei, die Ränder von Solarzellen leicht und effizient zu unterscheiden. Die optimale Dichte variiert je nach Zellgröße. Eine zu hohe Konzentration von Goldpartikeln beeinträchtigt die Beweglichkeit der Zellen, während eine zu niedrige Konzentration an Goldpartikeln die Fähigkeit einschränkt, eine genaue Bewegungsbahn abzugrenzen.

Aus diesem Grund sollten nur Deckgläser, die aus derselben Charge stammen oder deren Dichte als identisch kalibriert wurde, gemeinsam in einzelnen Experimenten verwendet werden. Falls die Konzentration der Goldpartikel unzureichend ist, weitere 0,5 bis 1 Milliliter der kolloidalen Goldlösung zu den mit Gelatine beschichteten Deckgläsern hinzufügen. Falls jedoch die Konzentration der Goldpartikel zu hoch ist, wie im hier gezeigten Fall, ist die einzige wirksame Möglichkeit, die kolloidale Goldlösung erneut herzustellen und neue Deckgläser zu beschichten.

Wenn die Partikeldichte korrekt ist, bringen Sie die Platte für eine Stunde bis über Nacht bei 37 Grad Celsius in den Inkubator. Spülen Sie anschließend ungebundene Goldpartikel ab, indem Sie die Deckgläser dreimal in sterilem, phosphatgepuffertem Kochsalzlösung (PBS) eintauchen. Lagern Sie die mit kolloidalem Gold beschichteten Deckgläser danach in mit PBS gefüllten Vertiefungen einer sauberen 12-Loch-Platte bei vier Grad Celsius, bis sie verwendet werden. Die Deckgläser dürfen nicht austrocknen und sollten innerhalb von zwei bis drei Monaten ab dem Herstellungsdatum verwendet werden.

Der nächste Schritt besteht darin, die mit kolloidalem Gold beschichteten Deckgläser für die Zellkultur vorzubereiten. Legen Sie sie dazu einzeln in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, denen zuvor jeweils etwa 0,3 Milliliter Kulturmedium hinzugefügt wurden, bevor die Deckgläser zugegeben werden. Übertragen Sie anschließend etwa 5.000 bis 50.000 Zellen auf jedes mit kolloidalem Gold beschichtete Deckglas. Die Zellanzahl variiert je nach Zelltyp, doch die Zelldichte muss niedrig genug sein, um ein Überlappen von Zellspuren mehrerer Zellen im selben Bereich zu verhindern.

Decken Sie die Platte ab und stellen Sie sie sechs bis 24 Stunden lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Basierend auf der Beweglichkeit des Zelltyps sollte der optimale Zeitraum für jeden Zelltyp experimentell bestimmt werden. Nach der Inkubation fixieren Sie Abdeckungsscheiben, die nicht sofort analysiert werden, indem Sie sie zunächst zweimal in PBS tauchen und anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur in 3 % Paraformaldehyd inkubieren. Erfassen Sie Bilder der Spuren, die von einer einzelnen wandernden Zelle auf nicht fixierten oder fixierten Abdeckungsscheiben erzeugt wurden. Die zur Aufnahme der zellulären Spuren verwendete Vergrößerung variiert je nach Zelltyp. Es muss jedoch für jede Studie dieselbe Vergrößerung verwendet werden, um die Ergebnisse vergleichen zu können.

Für Monozyten eignet sich eine 40-fache Vergrößerung, wobei frei verfügbare Software wie Image, NIH Image oder Image Tool verwendet werden kann, um die durchschnittliche Fläche zu bestimmen, die von 10 bis 20 oder mehr Zellen pro Probe von kolloidalem Gold geräumt wurde. Auf den hier gezeigten Aufnahmen ist der von kolloidalen Goldpartikeln geräumte Pfad eines einzelnen nicht stimulierten Monozyten mit einem 40-fachen Objektiv sichtbar. Nicht bewegliche Zellen erzeugen charakteristische kleine ovale oder kreisförmige Spuren um sich herum, was auf ein geringes Maß an Bewegung hinweist. Im Gegensatz dazu zeichnen sich hochbewegliche Zellen durch gerichtete Bewegung aus, die sich in langgestreckten Bahnen und größeren Gesamtflächen widerspiegelt, bedingt durch ihre unregelmäßigen Formen.

Zellspuren werden am besten analysiert, indem man mit dem Freihand-Werkzeug in der Image-J-Software ihr Volumen umreißt. Anschließend können quantitative Flächenmessungen mit dem Messwerkzeug im Analysemenü von Image J durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich strikt an die im Protokoll angegebenen Volumina und Temperaturen zu halten, da Abweichungen die Endergebnisse stark beeinflussen können. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gelatine-beschichtete Deckgläser herstellt, wie man Gold-Nanopartikel sowie mit Gold-Nanopartikeln beschichtete Deckgläser vorbereitet und wie man Zellbewegungen mittels Lichtmikroskopie verfolgt und quantitativ auswertet.

Es sollte nicht vergessen werden, dass das Arbeiten mit siedenden Lösungen auf einer Heizplatte, insbesondere Dämpfe aus der siedenden Lösung von Fluoro, AIC-Säure und Natriumcitrat, gefährlich sein kann; Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten im Abzug und die Anwendung von gesundem Menschenverstand sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.