Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Mäuse mit einem modifizierten menschlichen Immunsystem zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Maus auf die Operation vorbereitet und im zweiten Schritt der Trokar mit einem Stück Thymus beladen wird. Matrigel wird mit CD34-negativen und CD34-positiven transduzierten Zellen gemischt, und die Mischung wird anschließend dem Trokar zugefügt.

Anschließend werden die Matrigel-Konstrukte unter die Nierenkapsel transplantiert. Letztendlich kann die Abstoßung der Ziel-Tumore durch genetisch modifizierte CD8-T-Zellen mittels lebendigen PET-Bildgebungsverfahren und physischen Tumormessungen überwacht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie vollständig humanen Modellen besteht darin, dass mit ihr die Entwicklung genetisch veränderter menschlicher Stammzellen im menschlichen Thymus sowie anschließende In-vivo-Wirksamkeitsprüfungen der abgeleiteten Zelllinien untersucht werden können. Die Durchführung des Verfahrens erfolgt durch drei Techniker aus unseren Laboren: Gregory Bristol, Bernard Levin und Sean Kim.

In diesem schematischen Diagramm ist das modifizierte BLT-Modell dargestellt, das in diesen Studien zur Erzeugung chimärer Mäuse mit mart, einer spezifischen T-Zelle, verwendet wurde. Das Th-Implantat wird aus transduzierten und nicht transduzierten CD34-Zellen rekonstruiert, die aus einer autologen fetalen Leber isoliert wurden. Ein Teil der transduzierten Zellen wird anschließend eingefroren und vier bis sechs Wochen später in bestrahlte Mäuse injiziert.

In diesem Video wird die Implantation des lebenden Konstrukts gezeigt, sobald die Tiere aufgrund der Anästhesie träge geworden sind. Beginnen Sie damit, die linke Seite jedes Mäuses von der Hüfte bis zur Schulter zwischen der Körpermitte und dem Bauch zu rasieren. Nachdem das Gewicht jedes Tieres aufgezeichnet wurde, werden die Ohren zur Nummerierung gestanzt und subkutan 0,3 Milliliter Carprofen in jede Schulter injiziert.

Legen Sie dann die Mäuse auf die rechte Seite, sodass sie nach links blicken. Spülen Sie nun den Trokar einer 16-Gauge-Krebsimplantationsnadel mit abgerundeter Feile-Spitze mit PBS aus. Fügen Sie mit einer Pinzette ein Stück Thymus in die Schale mit PBS hinzu und halten Sie anschließend den Trokar horizontal mit der Stange.

Saugen Sie das Gewebe kurz unterhalb der Spitze an. Das Unterführen des Trokars unter die Nierenkapsel und das Injizieren des Gewebes gehören zu den anspruchsvollsten Schritten dieses Verfahrens. Danach benötigen Sie einen Helfer.

Verwenden Sie eine positive Verschiebungs-Pipette, um fünf Mikroliter kaltes Matrigel unter vorsichtigem Rühren in ein Röhrchen mit Zellen einzumischen. Halten Sie den Trokar horizontal. Ziehen Sie langsam den Stab zurück, während der Helfer das Matrigel pipettiert.

Für jede Maus in den Trokar einmischen. Zuerst die bloße Haut des Tieres mit Betadine abwischen und anschließend mit einem Isopropanol-Tupfer abwischen. Zweimal den dunkelsten Punkt unter der Haut bestimmen, der die Lage der Milz anzeigt.

Die Niere befindet sich etwa fünf Millimeter dorsal zur Milz; heben Sie mit einer stumpfen Pinzette die über der Niere liegende Haut an. Führen Sie einen etwa 15 Millimeter langen Schnitt in der Haut parallel zur Milz durch. Führen Sie einen ähnlichen Schnitt in der darunterliegenden Bauchfellmuskelschicht durch.

Beim Männchen sollte die Niere direkt sichtbar sein. Drücken Sie einfach auf den Bauch, um die Niere hervorzutreten zu lassen. Halten Sie mit der linken Hand Druck auf den Bauch aufrecht, um die Niere bei Weibchen freiliegen zu lassen; heben Sie zunächst mit einer Hämoklippe den Ovar auf und ziehen Sie dann die Niere heraus, um das Organ außerhalb des Körpers zu fixieren.

Ziehen Sie eine kleine Öffnung am hinteren Ende der Nierenkapsel auf und schieben Sie dann den Trokar in diese Öffnung und entlang der Niere, bis die Öffnung des Trokars vollständig von der Nierenkapsel bedeckt ist. Injizieren Sie anschließend mit dem kleinen Finger der rechten Hand das Gewebe. Benutzen Sie nun den geschlossenen Hämostatikum, um die Niere vorsichtig wieder in ihre Position zurückzuschieben.

Legen Sie einen Stich in das Peritoneum mit einer Doppelschleife, ziehen Sie die Haut wie einen Beutel zusammen und setzen Sie dann zwei Wundklammern. Geben Sie abschließend einen Tropfen PBS auf jedes Auge und legen Sie die Maus seitlich in einen Käfig auf Einstreu. Nachdem alle Mäuse auf dieselbe Weise implantiert wurden, überprüfen Sie, ob die Tiere wieder auf dem Bauch liegen, bevor Sie sie allein lassen.

Diese erste Abbildung zeigt ein repräsentatives Bild des lebenden THI-Implantats in humanisierten Mäusen. In dieser Abbildung wird die normale Entwicklung des Thymusgewebes sowie die physiologische Verteilung der menschlichen, CD vier- und CD acht-positiven T-Zellen demonstriert. Nach der Rekonstitution tragen die Tiere ein menschliches Immunsystem mit einer normalen Verteilung von CD vier- und CD acht-positiven T-Zellen.

Hier ist ein repräsentatives Bild einer Maus mit einem Melanomtumor dargestellt. Die grauen Bereiche zeigen das CT-Schichtbild. Die farbigen Bereiche zeigen die vom PET-Scan erfasste Stoffwechselaktivität des Tumors an.

Der CT-Scan allein zeigte in diesem Experiment eine große Tumormasse in dem durch den weißen Kreis markierten Bereich. Wie die in vivo PET-Bildgebung jedoch verdeutlicht, besteht dieser Bereich hauptsächlich aus nekrotischem und Narbengewebe, was die Nützlichkeit der PET-Bildgebung als empfindlichere und genauere Methode zur Beurteilung der Tumorregression und -beseitigung unterstreicht. Nach dieser Prozedur können weitere Analysen wie T-Zell-, Phänotypisierungs- und ex-vivo-Aktivierungsassays durchgeführt werden, um Fragestellungen im Zusammenhang mit der T-Zell-Funktion zu beantworten.