Eine optimierte Methode für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Isolierung von Autonomic neuralen Vorläuferzellen aus inneren Organen des Fötus Mäuse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Population gereinigter neuronaler Vorläuferzellen aus Ganglien des peripheren Nervensystems zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Organ oder die spezifischen Ganglien des Interesses von fötalen Mäusen präpariert werden. Anschließend werden die Gewebe teilweise dissoziiert, um die einzelnen Zellen in das umgebende Medium freizusetzen.

Anschließend wird die Zellsuspension filtriert, um verbliebene Gewebeklumpen oder große Aggregate zu entfernen. Schließlich erfolgt eine Durchflusszytometrie zur Isolierung der Population von Interesse, basierend auf der Expression eines fluoreszierenden Reporters in dieser Zellpopulation. Letztendlich können Genexpressionsmuster zwischen Vorläuferzellen, die in verschiedenen Entwicklungsstadien isoliert wurden, oder zwischen gereinigten Populationen unterschiedlicher neuronaler Zelltypen verglichen werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der Isolierung von Zellpopulationen basierend auf Antikörperfärbung liegt darin, dass oft keine Immunreagenzien verfügbar sind, die Zellen markieren, die ein bestimmtes Gen exprimieren. Genetisch veränderte Mauslinien, die fluoreszierende Proteine in definierten neuronalen Teilpopulationen produzieren, ermöglichen die Isolierung dieser Zellpopulationen. Obwohl wir diese Methode zur Isolierung neuraler Vorläuferzellen aus dem Darm und der neurogenen Zone des Mundes demonstrieren, kann sie ebenfalls auf andere Modellsysteme angewendet werden, die fluoreszierende Reportergene exprimieren.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da sie dazu neigen, das Ausgangsgewebe übermäßig zu verdauen, was zu einem Verlust der Zellviabilität führt. Vor Beginn der Dissektion sollten die Embryonen mittels Hellfeldbeleuchtung betrachtet werden, um sicherzustellen, dass die relevanten Strukturen scharfgestellt sind. Anschließend identifizieren Sie die transgen-positiven Embryonen durch Screening auf die Expression des fluoreszierenden Reporters unter Verwendung eines fluoreszenzfähigen Stereomikroskops.

Nach der Tötung beginnen Sie damit, eine minimale Menge PBS in die Präparierschale zu geben, damit das Embryo beim Dissektieren der Gewebe nicht schwimmt. Öffnen Sie die Haut des Embryos entlang der Körperseiten und quer über den Bauch auf Höhe der Leber. Drehen Sie das Embryo auf den Rücken und befestigen Sie es mit feinen Pinzetten an Ort und Stelle.

Auf der Ebene der Vordergliedmaßen ein weiteres Paar Pinzetten auf Höhe des Zwerchfells einsetzen und dann zügig ziehen. Die inneren Organe nach unten in Richtung Schwanz und vom dorsalen Körperwall wegziehen, um die Eingeweide von der Leber bis zum Genitalhöcker zu entfernen. Falls Organe aus der Brusthöhle, wie Herz oder Lunge, mit den Eingeweiden verbunden herauskommen, diese vor Fortsetzung der Prozedur entfernen.

Nachdem die Baucheingeweide vom Kadaver getrennt wurden, bringen Sie eine Pinzette unterhalb der Leber in der Nähe des Magens an und lösen Sie vorsichtig die Leber vom Darm. Danach dissezieren Sie den Hinterdarm vorsichtig vom dorsalen Harnrohrenkanal ab und entfernen Sie den Darm aus dem Urogenitaltrakt. Schließlich drehen Sie den Darm um, sodass die Milz unterhalb des Magens sichtbar ist.

Entfernen Sie Milz und Bauchspeicheldrüse. Ziehen Sie die Darmabschnitte auseinander, indem Sie das Mesenterium festhalten. Entfernen Sie dann vorsichtig das Mesenterium zusammen mit der zugehörigen Gefäßversorgung vom Darm, indem Sie sanft am Mesenterium ziehen.

Vermeiden Sie es, den Darm direkt mit der Pinzette zu halten. Falls der Darm bricht, sammeln Sie die einzelnen Stücke einfach in der Dissoziationsphase. Sammeln Sie jeden Gewebetyp entsprechend Gewebetyp und Embryophänotyp gemeinsam in einem 15-Milliliter-Konischgefäß, das eiskaltes HBSS enthält.

Nach dem Pellettieren saugt man das HBSS aus den subdissezierten Geweben so vollständig wie möglich ab. Anschließend resuspendiert man das Gewebepellet in einem bis mehreren Millilitern ACU max. Dabei wechselt man die Pipettenspitzen zwischen jeder Probe.

Um eine Kreuzkontamination von Gewebetypen zu vermeiden, die Röhrchen 20 bis 45 Minuten lang in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius stellen. Je nach Entwicklungsstadium des zu isolierenden Gewebes ist die Dissoziation und Filtration des Gewebes der schwierigste Teil des Verfahrens, um eine übermäßige Dissoziation des Gewebes und infolgedessen eine geringe Zellviabilität zu verhindern.

Begrenzen Sie die Dissoziationszeit und versuchen Sie nicht, alle Gewebestücke zur Hälfte der Zeit vollständig zu dissoziieren. Gegen Ende der Dissoziationszeit zerkleinern Sie das Gewebe manuell, indem Sie das Röhrchen kräftig gegen die Seite des Wasserbades schlagen und es mit einer schnellen Handgelenkbewegung nach unten schnipsen. Stellen Sie die dissoziierten Proben nun auf Eis und geben Sie sofort je einen Milliliter frisch zubereitete Quench-Lösung unter Verwendung einer neuen Pipettenspitze pro Probe hinzu. Pipettieren Sie die Probe mehrmals auf und ab, bis das Gewebe nahezu vollständig dissoziiert ist.

Verwenden Sie nun eine mit Ethanol sterilisierte Pinzette, um ein drei Zentimeter großes Quadrat einer 38-Mikron-Nylon-Maschennetzhaut über die Öffnung eines neuen 15-Milliliter-Konikalrohrs zu legen. Filtern Sie dann mithilfe von Spitzen mit schmaler Bohrung die einzelnen resuspendierten Zellsuspensionen durch die Membran, indem Sie die Probe in die Mitte der Membran pipettieren. Nachdem die Zellsuspension filtriert wurde, spülen Sie das Probenröhrchen mit einem Milliliter Quench 1 zu 5 aus und filtern alle verbleibenden Zellen.

Entfernen Sie dann die Membran, wobei darauf geachtet werden muss, dass keine ungefilterten Gewebeproben in das Röhrchen gelangen. Nach dem Aufpelletieren saugen Sie den Überstand der Zellsuspensionen ab und resuspendieren das Pellet in einem Milliliter Quench 1 zu 5. Filtern Sie anschließend jede Zellsuspension wie eben gezeigt durch ein Nylon-Netz in fünf Milliliter fassende Polystyrol-Röhrchen.

Heben Sie zunächst eine kleine Aliquotprobe der Fluoreszenzprobe für die EGFP-einzelne Kompensationskontrolle auf. Teilen Sie dann die Wildtyp-Gewebeprobe in zwei Portionen auf, wobei eine als Wildtyp allein und die andere als sieben A a d.Only markiert wird. Füllen Sie nun alle Probenröhrchen mit Quench eins bis fünf und aspirationieren Sie nach dem Pellettieren der Proben in jedem Röhrchen alles bis auf die letzten 200 Mikroliter Überstand.

Fügen Sie abschließend sieben A a D zu den zu sortierenden Proben und der Kontrolle mit nur sieben A a D hinzu. Geben Sie dann 0,75 Milliliter Triazol-LS zu 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Beginnen Sie beim Sammeln der Proben mit den Kontrollproben, um die Kompensationsparameter und Tore einzustellen, um sieben A a D-positive tote Zellen auszuschließen, und sammeln Sie Zellen mit hoher GFP-Fluoreszenzintensität.

Nach der Einstellung der Kompensationsparameter die Sortierung mit dem niedrigstmöglichen Druck, einer Weitdurchmesser-Düse und einer geringen Durchflussrate beginnen. Pro Mikrozentrifugenröhrchen maximal 25.000 Zellen sammeln, damit das Triol-LS nicht übermäßig verdünnt wird. Unmittelbar nach der Sortierung jedes Röhrchen mit in Triol-LS gesammelten Zellen vortexen.

In dieser ersten Abbildung ist ein Ganzpräparat des urogenitalen Trakts eines 15,5 Tage nach der Begattung alten Embryos dargestellt, das ventral im Hellfeld beleuchtet wurde. Derselbe Präparat wird im Fluoreszenzlicht gezeigt, um die Verteilung der EGFP-positiven Zellen in der Nebenniere und den medial gelegenen Zöliakganglien aufzuzeigen, die anhand ihrer TH-EGFP-Transgenexpression identifiziert wurden. Diese Seitenansicht eines 15,5 Tage nach der Begattung alten, subdissezierten Blasenpräparats von TH-EGFP-Mäusen zeigt Fluoreszenz der Transgenexpression in den Beckenganglien, der Blasenwand und der Harnröhre.

In dieser dorsalen Ansicht derselben sind EGFP-positive Zellen im anterioren dorsalen Urethragewebe erkennbar. Die Gewebedissoziation zur Herstellung von Zellsuspensionen für die Durchflusszellseparation erfordert ein feines Gleichgewicht zwischen ausreichender enzymatischer Verdauung und der Vermeidung einer Überverdauung, die zu geringer Zellviabilität führen kann. Diese Fotomikroskopieaufnahmen zeigen Gewebe des unteren Harn- und Geschlechtsapparats sowie des Darms zur Hälfte der Dissoziationszeit. Wie auf diesen Aufnahmen angemessen verdauter Gewebe vor und nach manueller Bearbeitung zu sehen ist, sind Fragmente von subdissezierten Organen in Geweben, die zu lange oder mit zu hoher Enzymkonzentration enzymatisch behandelt wurden, weiterhin deutlich erkennbar.

Jedoch weist die resultierende Suspension keine verbleibenden großen Gewebestücke auf; eine geeignete Dissoziation und manuelle Filtration erzeugt Durchflusszytometrieprofile, die typischerweise über 90 % lebensfähige Zellen aufweisen, wobei die Zellen in dieser lebensfähigen Population den Reporter hochgradig exprimieren und einen intensiven EGFP-Signal ausweisen. Die schwarze Population besteht aus Einzelzellen, die tot sind und durch Aufnahme des Fluoreszenzfarbstoffs Seven AAD markiert wurden. Die graue Population besteht aus Einzelzellen, basierend auf Vorwärts- und Seitenstreuung, die Seven AAD ausgeschlossen haben und somit lebensfähig sind.

Die grüne Population stammt aus dem geöffneten GFP-positiven Bereich und besteht aus einzelnen vitalen Zellen, die sieben A a d ausgeschlossen haben und die EGFP-Fluoreszenz aufweisen. Mit diesem Verfahren kann die Isolierung neuronaler Vorläuferzellen aus anderen peripheren Geweben wie der sympathischen Kette, den dorsalen Wurzelganglien oder der Lunge durchgeführt werden, um Fragen zu Unterschieden in den Genexpressionsprofilen zwischen Populationen oder zur Entwicklung unterschiedlicher Zelllinien zu beantworten.