Heterotypische Dreidimensionale

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, dreidimensionale typische Modelle der frühen Ovarialkarzinomentwicklung zu erzeugen. Erzeugen Sie zunächst H turt-immortalisierte Zelllinien, die aus primären, normalen ovariellen Epithel- und Fibroblastengeweben stammen. Anschließend werden die in vivo vorhandene Architektur sowie die komplexen Zell-Zell-Interaktionen im Eierstock durch eine Kokultur von epithelialen und stromalen Zelllinien in dreidimensionalen S-Sphäroidmodellen nachgebildet. Danach werden die Organoidkulturen fixiert und gefärbt, um die Expression spezifischer Marker zu analysieren und molekulare Merkmale der Strom-Epithel-Interaktionen zu untersuchen.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, wie Veränderungen im stromalen Zellkompartiment dreidimensionaler typischer Modelle den Phänotyp ko-kultivierter epithelialer Zellen beeinflussen können. Dreidimensionale typische Modelle können dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der Ovarialkarzinom-Forschung zu beantworten, beispielsweise die Erforschung der Entstehungsursachen dieser Erkrankung sowie die Aufklärung der Rolle der stromalen Mikroumgebung bei der Tumorentstehung und -entwicklung. Die Anwendung dieser Techniken reicht im Vergleich zu anderen 3D-Kultivierungsmethoden bis hin zur Diagnose und Therapie von Erkrankungen.

Diese Technik kann auf ein breiteres Spektrum an Zellkulturvolumina und nachgeschaltete Anwendungen angewendet werden. Beispielsweise können 3D-homo- und typische Kulturen für die In-vitro-Wirkstoffprüfung verwendet werden. Der Ansatz kann auch auf andere Modellsysteme angewendet werden, wie beispielsweise bei der Untersuchung anderer solider Tumortypen oder bei gutartigen Erkrankungen.

Transportieren Sie das frische Ovarialgewebe in einem Wachstumsmedium für immortalisierte normale Ovarialfibroblasten, das mit zusätzlichen Antibiotika und Antimykotika angereichert ist, in das Zellkulturlabor. Waschen Sie die Probe dreimal mit je fünf Milliliter PBS, um eventuell locker am Gewebe anhaftende epitheliale Zellen zu entfernen. Danach überführen Sie die Probe zusammen mit dem PBS in eine saubere P-100-Kulturschale. Übertragen Sie das Gewebe mithilfe steriler Instrumente in eine zweite trockene, saubere P-100-Kulturschale.

Schneiden Sie das Gewebe in Stücke von 0,5 Quadratzentimetern und überführen Sie jedes Stück in eine separate P-100-Schale. Setzen Sie das Zerschneiden des Gewebes fort, bis die Stücke kleiner als ein Quadratmillimeter sind. Geben Sie dann 20 Milliliter INOF-GM-Medium hinzu und kultivieren Sie; überwachen Sie das Zellwachstum mittels Phasenkontrastmikroskopie.

Überprüfen Sie, ob die Zellen innerhalb von 24 Stunden an der Schale haften. Überwachen Sie das Zellwachstum mittels Phasenkontrastmikroskopie. Normalerweise heften sich die Zellen innerhalb von 24 Stunden an. Nach einer Woche entfernen Sie jegliches nicht-angewachsene Gewebe durch Absaugen, erneuern das Medium und füttern die Kulturen danach ein- bis dreimal pro Woche, sobald die Zellkolonien eine Größe von etwa 500 Mikrometern erreichen.

Isolieren Sie die Klone mithilfe von Triplicaten und beschichteten Klonierungsscheiben. Um fibroblastische Zellen zu 100 % zu bestätigen, geben Sie eine Probe der Zelllinie auf Glasdeckgläser und führen eine immunfluoreszenzchemische Färbung für einen fibroblastischen Marker, einen epithelialen Marker und einen endothelialen Zellmarker durch.

Ein Tag vor der retroviralen Transduktion von H Turt-Passagen werden die normalen ovariellen Fibroblasten-Zellisolate von einer einzelnen P-100-Schale in drei P-100-Schalen überführt. Vorgefertigte virale Überstände können gekauft oder im Labor mithilfe standardisierter Protokolle zur Cotransfektion von HEC 2 9 3 T-Zellen hergestellt werden. Um die Poly-Hema-Lösung vorzubereiten, wiegen Sie 1,5 Gramm Poly Hema ab und geben Sie es in eine sterile Flasche.

Geben Sie 95 Milliliter absoluten Ethanol der Molekularbiologie-Reinheit und 5 Milliliter destilliertes Wasser der Zellkulturreinheit hinzu. Stellen Sie die Poly-Hema-Lösung in ein Wasserbad bei 65 Grad Celsius, bis sie vollständig gelöst ist. Beschichten Sie die Zellkulturschalen mit frisch hergestellter Poly-Hema-Lösung.

Trocknen Sie die Zellkulturschalen in der laminaren Luftwerkbank luftdicht. Ein sanftes Schaukeln auf einer Schüttelplattform kann verwendet werden, um eine gleichmäßige Beschichtung von größeren Schalen oder Kolben sicherzustellen. Wenn die Polyus-Lösung zu schnell trocknet, wird die Oberfläche nicht glatt sein.

Falls gewünscht, können die Fibroblasten vor der 3D-Kultur vorbehandelt werden, beispielsweise durch Gabe subletaler Dosen von Wasserstoffperoxid zur Induktion von Zellalterung. Gewinnen und vermehren Sie die INOF- und epithelialen Zellkulturen in vitro, um eine ausreichende Zellzahl für die Herstellung von 3D-heterotopen Steroiden zu erhalten. Nach einem fünfminütigen PBS-Spülschritt fügen Sie 15 Milliliter Medium in die Poly-Hema-Platte hinzu.

Unterdessen Trypsin zu den immortalisierten normalen ovariellen Fibroblasten hinzufügen, um sie von der Kulturschale zu lösen. Nach drei bis fünf Minuten das Trypsin mit einem gleichen Volumen Kulturmedium neutralisieren und die Zellen durch Zentrifugation gewinnen. Den Zellpellet in fünf Milliliter Medium resuspendieren und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren oder vorsichtiges Vortexen gut mischen.

Verwenden Sie anschließend eine 10-Mikroliter-Probe, um lebensfähige Zellen mit Trypanblau zu zählen. Geben Sie nun 4 Millionen INOF-Zellen in das Medium, das bereits in die mit Poly-Hema beschichtete Platte pipettiert wurde. Ergänzen Sie das Kulturmedium auf ein Volumen von 20 Millilitern und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.

Überwachen Sie die zelluläre Aggregation zu multizellulären Steroiden mittels Phasenkontrastmikroskopie, um die S-Sphäroidkulturen alle zwei bis drei Tage erneut zu versorgen. Stellen Sie die Platten schräg auf eine Pipette. Lassen Sie die Sphäroide absinken und entfernen Sie vorsichtig etwa 16 Milliliter des erschöpften Mediums mit einer 5-Milliliter-Pipette.

Geben Sie 16 Milliliter frisches Medium zur Kultur hinzu und kehren Sie am siebten Tag in den Inkubator zurück. Erstellen Sie heterotypische Kulturen, indem Sie epitheliale Zellen zu den Fibroblasten phe hinzufügen. Bereiten Sie zunächst Suspensionen von ovariellen epithelialen Zellen durch Trypsin wie zuvor nach der Zellzählung beschrieben vor.

Einmal mit INOF-GM-Medium waschen, um sicherzustellen, dass keine Wachstumsfaktoren aus dem epithelialen Wachstumsmedium übertragen werden. Nach dem Erneuern des Mediums der Fibroblasten-OID-Kulturen die epithelialen Zellen im Verhältnis von vier Fibroblasten zu einer epithelialen Zelle hinzufügen. Die heterotopen OIDs in INOF GM werden typischerweise alle zwei bis drei Tage umgefrischt und weitere 14 Tage kultiviert.

Bei der Immunhistochemie fixieren Sie das PHE mit neutral gepuffertem Formalin, pelletieren das PHE und ersetzen das Formalin durch 70 % Ethanol. Fahren Sie fort, indem Sie das Material gemäß Standardprotokollen für humanes Gewebe in Paraffin einbetten. In Paraffin eingebettete Steroide können geschnitten und mit H und E oder spezifischen molekularen Markern mittels Immunhistochemie gefärbt werden.

Alternativ waschen Sie die Steroide in PBS und fixieren Sie sie in 4 % Paraformaldehyd. Anschließend werden die Proben in OCT-Medium eingebettet und schnell eingefroren, um Schnitte im Kryostaten herzustellen und immunfluoreszenzfärbungen für die Analyse per Durchflusszytometrie durchzuführen. Waschen Sie die Steroide in PBS und lösen Sie sie durch Trypsin- oder Accutase-Digestion bei 37 Grad Celsius auf.

Die vollständige Dissoziation von Steroiden in eine Einzelzell-Suspension kann durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren der Lösung mit einer 1-mL-Pipettenspitze gefördert werden. Achten Sie darauf, die Zellen nicht zu stark zu belasten. Neutralisieren Sie die Reaktion mit einem gleichen Volumen an Kulturmedium und entfernen Sie Zellklumpen, indem Sie die Suspension durch einen Zellfilter mit einer Porengröße von 40 bis 70 µm geben. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert, mit PBS gewaschen, die gewünschte Anzahl an Zellen in FACS-Puffer resuspendiert und gemäß den Herstelleranweisungen gefärbt. In unserem Labor haben wir partiell transformierte ovarielle Epithelzellen hergestellt und diese mit normalen sowie seneszenten ovariellen Fibroblasten kultiviert, um die Entwicklung eines Ovarialkarzinoms im Frühstadium nachzuahmen.

In einer prämenopausalen Ovar-Immunfluoreszenzfärbung zeigen h hert immortalisierte normale ovarielle Fibroblasten, dass sowohl primäre normale ovarielle Fibroblasten als auch immortalisierte normale ovarielle Fibroblasten das fibroblastenspezifische Protein exprimieren, jedoch weder Zytokeratin sieben noch Menton exprimieren. Normale ovarielle Fibroblastenzellen, allein in 3D-kultiviert mit PHE, weisen eine spindelförmige Morphologie und eine reichliche extrazelluläre Matrix auf. Hier wurden normale ovarielle Fibroblasten sieben Tage lang Wasserstoffperoxid ausgesetzt, um Seneszenz hervorzurufen, und anschließend 14 Tage lang gemeinsam mit teilweise transformierten ovariellen Epithelzellen kultiviert.

Um die beiden Zelltypen zu unterscheiden, wurden die resultierenden Steroide immunhistochemisch mit Mim-1 als Proliferationsmarker und Panzytokeratin als epithelialem Marker gefärbt. Die Quantifizierung der Daten legt nahe, dass die alternde Mikroumgebung neoplastische Merkmale teilweise transformierter epithelialer Zellen fördert, während eine normale Mikroumgebung das neoplastische Fortschreiten hemmt. Histologische Merkmale von normalen und malignen Zellen, die nicht nachweisbar sind, wenn die Zellen als Monolayer kultiviert werden, werden wiederhergestellt. Wenn die Zellen beispielsweise in eine Sphäroidkultur überführt werden, können histologische Merkmale von klarzelligem Ovarialkarzinom in 3D-Kulturen von klarzelligem Ovarialkarzinom-Zelllinien nachgewiesen werden, nicht jedoch in Monolayer-Kulturen derselben Zellen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dreidimensionale typische Kulturen einrichtet, um die Wechselwirkungen zwischen epithelialen und stromalen Zellen während der frühen Tumorgenese zu untersuchen. Bei der Einrichtung einer 3D-Kultur ist es wichtig, die Zellzahlen entsprechend der nachgeschalteten Anwendung anzupassen, wobei ein gewisser Materialverlust während der Aufarbeitung berücksichtigt werden sollte.

Wenn einmal beherrscht, können 3D-Kulturen innerhalb einer Stunde nach dieser Anleitung eingerichtet werden. Andere Methoden wie die Durchflusszytometrie in Kombination mit der Genexpressions-Mikroarray-Profilierung können durchgeführt werden, um die globalen Genexpressionsänderungen zu analysieren, die in 3D-typischen Kulturen auftreten, jedoch unter Monolayer-Kulturbedingungen nicht nachgewiesen werden. Dies ermöglicht die Aufklärung der bidirektionalen Signalwege, die spezifisch unter einem 3D-Kernkultur-Mikroumfeld auftreten.