Imaging Calcium Antworten in GFP-markierten Neuronen des Hypothalamus Maus Hirnschnitten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, stimulierte Kalziumantworten sowohl räumlich als auch zeitlich in Gehirnschnitten mit einem nicht grün fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoff zu überwachen, und zwar speziell in GFP-markierten Neuronen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn einer transgenen Maus gewonnen wird, die GFP in bestimmten Zellen exprimiert. Der zweite Schritt besteht darin, Gewebeschnitte mit einem Mikrotom herzustellen.

Anschließend wird die Beladungslösung mit dem Kalziumindikatorfarbstoff mittels Pipette auf die Schnitte aufgebracht, damit der Farbstoff von den Gehirnzellen aufgenommen werden kann. Im letzten Schritt erfolgt eine zeitsynchronisierte Aufnahme fluoreszierender Zellen mittels konfokaler Mikroskopie. Letztendlich werden Kalziumantworten in mit GFP markierten Neuronen mittels multicolor Kalzium-Bildgebungsanalyse dargestellt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass wir Kalzium in grün fluoreszierenden GFP-markierten Neuronen mithilfe eines rotverschobenen fluoreszenten Kalziumindikators einfärben können. Die große Stokes-Verschiebung des rotverschobenen Farbstoffs ermöglicht es uns, eine Multifarb-Analyse der roten Fluoreszenz in Kombination mit dem grünen GFP unter Verwendung einer einzigen Anregewellenlänge durchzuführen. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir mit dem Problem konfrontiert wurden, Kalziumsignale in Neuronen überwachen zu müssen, die wir nur anhand eines genetischen fluoreszierenden Markers identifizieren konnten, nämlich dem grünen Fluoreszenzprotein.

Ich werde nun verschiedene kritische Schritte dieses Verfahrens demonstrieren. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die erhitzte Agar-Lösung nach dem Abkühlen in eine quadratische Petrischale bis zu einer Höhe von einem Zentimeter einfüllen. Nach dem Erstarren wird das 4%ige Agar-Gel in Blöcke von einem Kubikzentimeter Größe geschnitten und zur Lagerung in eine Flasche gegeben. Nachdem die Maus entkopft wurde, schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Einweg-Rasierklinge in zentraler sagittaler Richtung vom Stirnbein bis zum äußeren Hinterhauptsprozess.

Öffnen Sie anschließend den eingeschnittenen Kopfhautbereich zunächst in rostral-lateraler Richtung, dann in ventraler Richtung. Führen Sie danach zwei laterale und einen rostralen Schnitt durch.

Am Foramen magnum mit einer kleinen Feder-Schere vorsichtig den Schädel abtrennen. Zu diesem Zeitpunkt sollten das okzipitale Interparietal- und die Parietalbeine gelöst werden. Falls die Dura mater noch vorhanden ist, vorsichtig mit einer Pinzette entfernen, um Schäden am Gehirn zu vermeiden.

Entfernen Sie anschließend das Squamale, das vordere ethmoidale Foramen und das frontale Foramen. Nun kann das Gehirn mithilfe einer umgekehrten mikroskopischen Löffelspatel leicht entfernt werden, und die Hirnnerven können durchtrennt werden. Das Gehirn sollte mit seiner ventralen Seite nach unten auf eine schnittfeste Oberfläche aufliegen, wobei die ventrale Gehirnfläche nach unten zeigt.

Entfernen Sie das Kleinhirn mit einer Einweg-Rasierklinge. Diese gerade Schnittfläche dient als Grundlage, um das Gehirn auf einer Platte zu befestigen, um koronale Gehirnschnitte anfertigen zu können. Anschließend kleben Sie das Gehirn mit der Schnittfläche auf die Basisplatte des Mikrotoms, indem Sie eine kleine Menge des schnell härtenden Hochleistungs-Cyanoacrylat-Klebers verwenden.

Kleben Sie anschließend einen Agar-Gel-Block von einem Kubikzentimeter an der ventralen Seite des Gehirns auf die Basisplatte des Mikrotoms, um das Gehirn während des Schneidens zu stützen und zu fixieren. Nachdem die Verbindung getrocknet ist, stellen Sie die Platte in das Bad des Mikrotoms, das eine mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung mit einer Temperatur von sechs Grad Celsius enthält. Schneiden Sie dann das Gehirn mit geringer Schneidgeschwindigkeit in Schnitte von 300 Mikrometer Dicke. Die koronalen Gehirnschnitte werden gesammelt, bis das gesamte Gehirn sectioniert ist.

Bereiten Sie nun eine 20%ige F1 27 in DMSO-Lösung vor, indem Sie DMSO-Lösung zu F1 27-Pulver hinzufügen. Lösen Sie es anschließend durch direktes Beschallen der Lösung für zwei Minuten auf. Danach geben Sie fünf Mikroliter der 20%igen F1 27-Lösung zu einem Gefäß mit 50 Mikrogramm zellpermeablem furred am.

Lösen Sie die Lösung mit einer Pipette. Geben Sie anschließend 45 Mikroliter extrazelluläre Lösung zur Mischung hinzu und wirbeln Sie sie. Geben Sie kurz darauf zusätzlich 325 Mikroliter extrazelluläre Lösung hinzu und beschallen Sie das Gefäß weitere drei Minuten lang.

Nach der Sonikation 1,156 Milliliter oxygenierte extrazelluläre Lösung hinzufügen, um die endgültige Beladungslösung mit dem Calciumindikator D zu erhalten. Die koronalen Hirnschnitte in eine sechswellige Zellkulturplatte überführen, die mit oxygenierter extrazellulärer Lösung gefüllt ist, mit bis zu sechs Schnitten pro Vertiefung. Anschließend die oxygenierte extrazelluläre Lösung aus den Kammern absaugen, wobei darauf geachtet werden muss, die Hirnschnitte nicht zu beschädigen.

Als Nächstes pipettieren Sie 750 Mikroliter der Calciumindikator-D-Lösung direkt in jedes Brunnenloch, sodass die Gehirnschnitte von der Lösung mit RoRE Am bedeckt sind. Danach inkubieren Sie die Schnitte 45 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius im Sauerstoff-Kohlendioxid-Zellkulturinkubator.

Am Ende der Inkubation ersetzen Sie die Beladungslösung mit dem Calciumindikator DI durch frische, mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung, um eine Überladung der Zellen zu verhindern. Um die durch den Reiz ausgelösten Änderungen des fluoreszierenden Signals zu überwachen, überführen Sie eine der mit Fure-rot beladenen Hirnschnitte in eine Ableitungskammer und positionieren Sie sie nach Wunsch. Nachdem die Kammer am konfokalen Mikroskopaufbau befestigt wurde, spülen Sie die Schnitte 10 Minuten lang mit mit Sauerstoff angereicherter extrazellulärer Lösung durch, um überschüssige extrazelluläre Calciumindikatorfarbstoffe zu entfernen.

Nachdem die PERFUSE acht die Aufnahmekammer verlassen hat, wird sie in einer Vakuumflasche gesammelt. Anschließend betrachten Sie das Schnittpräparat unter dem Mikroskop bei niedriger Vergrößerung. Notieren Sie die Orientierung des Schnitts und lokalisieren Sie den interessierenden Bereich im Schnitt, in unserem Fall den hypothalamischen Bereich im Gehirn.

Anschließend auf hohe Vergrößerung umstellen. Die Zelle von Interesse im Schnitt durch Erfassung von GFP-Bildern finden und gleichzeitig die Fluoreszenzintensität des URA-Rot-Signals überprüfen. Die Laserleistung auf einen Wert einstellen, der Messungen der Änderung der URA-Rot-Fluoreszenzintensität ermöglicht und eine Ausbleichung der beiden Fluorophore verhindert.

Als Nächstes beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern mit einer Frequenz zwischen 0,5 und zwei Hertz, um die Fure- und GFP-Signale zu erfassen. Diese Abbildung zeigt das konfokale Bild der GN-, RHR-Tau-GFP-Neurone in einer koronalen Gehirnschnittpräparation. Dies ist das relativ gleichmäßige Fluoreszenzsignal, das nach der Beladung des Gehirnschnitts mit Fure am beobachtet wird, und dies ist das überlagerte Bild, das die mit dem Kalziumindikatorfarbstoff beladenen Neurone zeigt.

Hier sind Beispiele für kalziumabhängige Antworten einzelner GFP-markierter Neuronen in verschiedenen hypothalamischen Hirnarealen, die durch somatische Reize ausgelöst wurden. Die unterschiedlichen Kalziumsignale zwischen den GN-RHR-exprimierenden Neuronen verschiedener hypothalamischer Kerne können mithilfe der Fläche unter der Kurve verglichen werden, die als Schätzwert für die gesamte Kalziumänderung in einem bestimmten Neuron während desselben Zeitraums dient. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in weniger als 90 Minuten durchgeführt werden, einschließlich der Vorbereitung des Kalziumindikatorfarbstoffs, des Beladens und der Inkubation der Schnitte, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird.