Reparatur eines Critical-sized Calvaria Defect Modells mit aus Fettgewebe gewonnenen Stromazellen aus Lipoaspirate Geerntet

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, multipotente stromale Zellen aus Fettgewebe zur osteogenen Differenzierung zu gewinnen, wobei ein in-vivo-Kalottendefektmodell an einer Maus verwendet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Vorläuferzellen aus der stromavaskulären Schicht des Fettgewebes isoliert werden, die nach einem Liposuktionsverfahren gewonnen werden kann. Der nächste Schritt besteht darin, ein dreidimensionales Gerüst herzustellen und anschließend die Zellen auf diesem Trägermaterial auszusäen.

Der letzte Schritt besteht in der Erzeugung eines kritisch großen kalvarialen Defekts in einem Rattenmodell, in den das Gerüst und die Zellen eingebracht werden. Letztendlich zeigen die Ergebnisse, dass multipotente stromale Zellen, die aus Fettgewebe isoliert wurden, das Potenzial für die skelettale Regeneration in vivo besitzen. Die Anwendungen dieser Technik umfassen ein breites Spektrum möglicher klinischer Anwendungen aufgrund des Mangels an verfügbarem Gewebe für die skelettale Regeneration.

Obwohl autologe Knochentransplantate den Goldstandard darstellen, sind sie durch einen Mangel an Spenderstellen und Spenderstelle-Morbidität begrenzt. Allogene Transplantate und Fremdmaterialien können verwendet werden, sind jedoch durch Kosten, schlechte Integration und potenzielle Infektionen eingeschränkt.

Die mögliche Verwendung von Fett- oder Fettgewebe zur Isolierung von Vorläuferzellen für das Engineering von Skelettgewebe ist vielversprechend. Die Demonstration des Verfahrens werde ich gemeinsam mit Michael Chung aus dem Long-Anker-Labor durchführen. Zunächst wird humanes subkutanes Fettgewebe aus elektiven Liposuctionsverfahren gewonnen.

Beachten Sie die beiden Schichten im Liposaugat. Das Überstand enthält den überwiegenden Teil des zellulären Materials aus dem Prozess. Die untere Schicht besteht hauptsächlich aus injizierter Kochsalzlösung.

Stromazellen aus Fettgewebe können aus beiden Schichten gewonnen werden, aber die Ausbeute ist aus dem Überstand deutlich größer. Um die stromavaskuläre Fraktion oder SVF-Waschung zu isolieren, wird das Liposaspirat umfassend mit gleichen Volumina eines x Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung oder PBS, das 2,5 % Betadine enthält, gewaschen und anschließend mit einem gleichen Volumen XPBS ohne Betadine versetzt. Man lässt die Waschung ausfallen.

Stellen Sie sicher, dass während des gesamten Vorgangs eine sterile Technik eingehalten wird, um eine Kontamination mit verarbeitetem menschlichem Gewebe zu vermeiden. Danach aspirieren Sie die untere Schicht und entsorgen Sie diese nach jeder Wäsche, dann überführen Sie 15 Milliliter Fettgewebe in 50-Milliliter-Falcon-Zentrifugenröhrchen. Anschließend verdauen Sie das Fettgewebe in 15 Milliliter filtrierter 0,075 % filtrierter Lösung.

Verdauen Sie Typ zwei Collagenase in Hank's Balanced Salt Solution oder HBSS bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad für 60 Minuten unter ständiger Agitation; stellen Sie sicher, dass Sie die Röhrchen alle 15 Minuten belüften. Neutralisieren Sie anschließend die Enzymaktivität mit 15 Milliliter PBS, das 10 % fetalen Kälberserum oder FBS enthält, und zentrifugieren Sie. Um ein pelletreiches stromalvaskuläres Fraktion (SVF)-Pellet zu erhalten, das aus einer Mischung von adipogenen Stammzellen und Erythrozyten besteht, führen Sie die Zentrifugation durch.

Entfernen Sie zuerst die überstehende Fettschicht und anschließend die überstehende Flüssigkeitsschicht, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 Milliliter herkömmlichem Wachstumsmedium. Kombinieren Sie dann drei Röhrchen in einem sauberen 50-Milliliter-Konischglas über einen 100-Mikron-Filter und zentrifugieren Sie.

Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie anschließend das Pellet. Kombinieren Sie zwei 50-Milliliter-Konischkolben pro 10-Zentimeter-Platte oder fünf 5-Milliliter-Konischkolben pro 15-Zentimeter-Platte in fünf Milliliter traditionellem Wachstumsmedium. Stellen Sie Primärkulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid ein.

Nach der Übernachtung die Platten mit PBS waschen, um restliche nicht-angewachsene rote Blutkörperchen zu entfernen. Die resultierenden Zellpopulationen sind aus Fettgewebe stammende Stromazellen. Die Zellen auf subkonfluenten Niveaus halten, um eine spontane Differenzierung zu verhindern.

Bei 37 Grad Celsius, 21 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. In Wachstumsmedium müssen die Zellen im Allgemeinen alle drei bis vier Tage im regulären Wachstumsmedium geteilt werden. Wenn sie bei 50 % Konfluenz angesät werden, bereiten Sie das Gerüst gemäß der dazugehörigen Veröffentlichung vor.

Wenn die Zellen subkoniuentes Wachstum erreicht haben, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und behandeln Sie sie mit Trypsin. Zählen Sie die Zellen, um sie zu quantifizieren. Bereiten Sie für die Aussaat die Zellen auf vorgeschnittenen Gerüsten mit vier Millimeter Durchmesser mit 1,5 × 10⁵ Zellen vor.

Legen Sie ein einzelnes Scaffold in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte und resuspendieren Sie die Zellen in regulärem Wachstumsmedium mit einer Konzentration von etwa 1,5 × 10⁵ Zellen pro 20 µL Medium. Besiedeln Sie das Scaffold, indem Sie 20 µL der Lösung direkt in das Scaffold pipettieren, und stellen Sie dies für 30 Minuten in den Zellkultur-Inkubator.

Nach 30 Minuten 200 Mikroliter Medium hinzufügen und die Zellen über Nacht auf dem Gerüst inkubieren lassen. Vor der Operation ist es nicht notwendig, die Adhäsion der Zellen auf dem Gerüst als Aussaat sicherzustellen. Eine ausreichende Anzahl von Zellen gewährleistet, dass die Mehrheit auf dem Gerüst anhaften wird.

Nach der Anästhesie eines erwachsenen, 60 Tage alten CD1-Nacktmäuses sterilisieren Sie die Operationsstelle dreimal mit Betadine und Alkohol und tragen Sie ein Augenschmiermittel auf die Augen der Maus auf. Anschließend führen Sie einen medianen sagittalen Hautschnitt in der Kopfhaut der Maus durch, um den rechten Parietalknochen freizulegen. Entfernen Sie die Pannikelhaut vom rechten Parietalknochen durch stumpfes Abkratzen.

Als Nächstes wird ein einseitiger, vier Millimeter großer Defekt in der vollen Dicke des rechten, nicht an Nähten liegenden Parietalknochens angelegt. Unter Verwendung eines Diamant-beschichteten Bohrers ist äußerste Vorsicht geboten, um die darunterliegende Dura mater nicht zu verletzen, da die Dicke des Schädeldaches bei der Maus vor der Implantation weniger als 0,3 Millimeter beträgt. Spülen Sie die Scaffolds mit steriler PBS, um die Übertragung wachstumsfaktorhaltiger Medien zu verhindern.

Platzieren Sie das Scaffold in den Defekt. Nähen Sie schließlich die Haut zu und überwachen Sie das Tier gemäß etablierter postoperativer Protokolle. Führen Sie eine Mikro-CT-Untersuchung am Mäuschen durch und gewinnen Sie ein 3D-rekonstruiertes Bild mithilfe der MicroView-Software.

Verwenden Sie Adobe Photoshop, um die Bilder auf eine Standardhöhe zu skalieren. In der Regel messen wir alle zwei Wochen die Regeneration des Schädeldaches. Die Mäuse werden während der Langzeitverfolgungsscan narkotisiert und letztendlich euthanasiert.

Verwenden Sie für die histologische Analyse die Zauberstab-Funktion, um die Pixel des kranialen Defekts zu messen. Bestimmen Sie den prozentualen Heilungsgrad des Defekts anhand nachfolgender CT-Scans. Messen Sie die Fläche des kranialen Defekts, ermitteln Sie die Pixelanzahl und teilen Sie diese durch die ursprüngliche Pixelanzahl des Defekts. Färben Sie mehrere Schnitte entlang der Ausdehnung des Defekts mit histologischen Färbemethoden wie Anilinblau und Pen-Aro, um die Osteogenese darzustellen.

Verwenden Sie Adobe Photoshop, um alle Bereiche, die nicht im kranialen Defekt liegen, auszuschneiden, und nutzen Sie den Zauberstab, um die Anzahl der Pixel der de novo Knochenbildung im Defektbereich zu bestimmen; vergleichen Sie dies mit Kontrollen oder anderen Variablen. Dargestellt ist hier eine Übersicht über die Gewinnung und Anwendung von Liposuktionat, von der Isolierung adiposetabstammiger stromaler Zellen über deren Expansion, Differenzierung bis hin zur Anwendung in vitro und in vivo. Hier sehen Sie eine Mikro-CT-Aufnahme, die die in vivo-Heilung eines kritisch großen kranialen Defekts nach Applikation von ASCs mittels eines Hydroxylapatit-Scaffolds zeigt, wie in der unteren Zeile zu sehen ist.

Die Steuerungen, die in der oberen Zeile zu sehen sind, umfassen keine Gerüststruktur und keinen Defekt. Die mittlere Zeile zeigt den Defekt mit der Platzierung des Gerüsts ohne Zellen. LS, das hier dargestellt ist, ist die Quantifizierung der knöchernen Heilung aus der Mikro-CT, die eine signifikant verbesserte Heilung in der A SC-Gruppe zeigt.

Dies ist ein histologisches Bild, das eine erhöhte Osteobildung in der A SC-Gruppe durch Andal zeigt. In Blau und Pen AROM-Färbung für Al. In Blau färbt das Osteoid dunkelblau für Pen AROM.

Die hier gelb angefärbte Osteoidsubstanz zeigt humane ASCs, die mit GFP markiert und auf ein Gerüst aufgebracht wurden und nach zwei Wochen entnommen wurden. Die Färbung erfolgte mit einem GFP-markierten Antikörper, um die Beteiligung der humanen Zellen an der Regeneration im Defektbereich darzustellen. Dargestellt ist hier die Immunchemie für humanes nukleäres Antigen, die nach zwei Wochen das Vorkommen humaner Zellen im Defektbereich zeigt.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann die Aufarbeitung des Fettgewebes innerhalb von vier Stunden erfolgen, und der chirurgische Eingriff dauert etwa 10 Minuten pro Maus. Es ist wichtig zu beachten, dass der Schädelknochen rund ist, während der Bohrer flach ist, weshalb sorgfältig darauf geachtet werden muss, den gesamten Umfang des vier Millimeter großen Defekts zu durchtrennen. Arbeiten Sie langsam, um die Dura mater des Gehirns nicht zu verletzen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Vorläuferzellen aus dem Fettgewebe isoliert. Säen Sie diese Zellen auf ein Gerüst auf und bringen Sie sie in die Maus ein.