Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die Reaktionen von Immunzellen auf bakterielle Toxine sichtbar zu machen. Zunächst wird das Toxin in BL 21 gold-Zellen exprimiert und daraus gereinigt. Nach Bestätigung der Toxinaktivität und -konzentration wird das Toxin den Immunzellen zugeführt.

Mithilfe eines Mikroinjektors und einer Hochgeschwindigkeits-Mikroskopie an lebenden Zellen wird die Analyse der resultierenden Bilder durchgeführt, die die Echtzeit-Kinetik der Immunzellantworten auf das Toxin offenbart. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise den Mechanismus der Inflammasom-Aktivierung.

Obwohl diese Methode Einblicke in toxisch vermittelte Immunzellantworten ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Stimuli wie chemotaktische Faktoren anwenden. Wir hatten ursprünglich die Idee zu dieser Methode, als wir die Interaktion von Bakterien mit kultivierten Immunzellen untersuchten und dabei stark variable Wechselwirkungen zwischen Bakterien und den Immunzellen beobachteten. Beginnen Sie die Reinigung von Streptolysin O oder SLO mit einer Kultur von BL 21 gold-Zellen, die das Plasmid PAG drei SLO enthalten.

Sein Plasmid wurde auf einen OD-Wert von etwa 0,6 herangewachsen. Um die Proteinexpression zu induzieren, fügen Sie fünf Milliliter 20 %iger OSes zur Kultur hinzu und schütteln sie drei Stunden lang bei 225 U/min bei Raumtemperatur. Überführen Sie anschließend die Bakterien in eine 500-Milliliter-Zentrifugenflasche.

Danach die Kultur bei 12.000 × g für 12 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren; nach der Zentrifugation das Überstand entfernen. Den Pellet über Nacht oder länger, falls erforderlich, bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um das exprimierte SLO zu reinigen, 10 Milliliter Lysepuffer, ergänzt mit Triton X-100, Lysozym und Phenylmethylsulfonylfluorid, zum gefrorenen Pellet hinzufügen und etwa 15 Minuten lang auf- und abpipettieren.

Um den Pellet wieder aufzuschwemmen, suspendieren Sie diesen unter Beibehaltung der Probe auf Eis. Überführen Sie den resuspendierten Pellet in eine 50-Milliliter-Rundboden-Polypropylen-Röhrchen vom Oak-Ridge-Typ. Sonifizieren Sie das Lysat mittels einer Sondensonikation bei 40 % Ausgangsleistung fünfmal jeweils 30 Sekunden lang mit 30-Sekunden-Intervallen und jeweils 30 Sekunden auf Eis dazwischen.

Danach die Sonikat-Lysatprobe 20 Minuten lang bei 39.000 × g und vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das bakterielle Überstandsgemisch zu einem Milliliter gewaschenen Nickel-NTA-Aros hinzufügen. Nickel-NTA-Aros und Lysat gemeinsam 2,5 Stunden bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln inkubieren.

Die Perlen durch Zentrifugation bei 400 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius pelletieren. Beachten Sie, dass alle weiteren Waschungen und die Elution mit diesen Zentrifugationsbedingungen durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Nach der Zentrifugation.

Vermischen Sie 30 Mikroliter des Überstands mit 10 Mikrolitern vierfachem SDS-Probenpuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie die Probe zur Reinheitsanalyse auf Eis. Entsorgen Sie anschließend den restlichen Überstand und waschen Sie die Kügelchen viermal mit Läusewaschpuffer sowie jeweils einmal mit Salzwaschpuffer, wobei nach jeder Waschung zentrifugiert wird. Ab diesem Zeitpunkt ist darauf zu achten, dass die Probe stets auf Eis gehalten wird.

SLO ist ein sehr redoxsensibles Protein, das schnell seine Aktivität verliert, wenn es auch nur für kurze Zeit auf 37 Grad Celsius erwärmt wird. Um das SLO-Protein zu eluieren, geben Sie ein Milliliter Elutionspuffer und fünf Mikroliter einmolariges DTT zu den Kügelchen, inkubieren Sie 10 Minuten auf Eis. Anschließend zentrifugieren und sammeln Sie das Überstand in einem Föhrchen, das mit der Elutionsnummer beschriftet ist.

Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal. Um dann Endotoxin aus dem SLO-Protein zu entfernen, geben Sie 200 µL gewaschene, polygemischt konjugierte Agro-Perlen, die in Res-Salz-Puffer suspendiert sind, zur Probe hinzu und schütteln bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Anschließend zentrifugieren Sie mit 10.000 ×g für eine Minute bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation sammeln Sie das Überstand in neuen, beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen.

Vermischen Sie 30 Mikroliter jeder Elution mit 10 Mikrolitern SDS-Probelösung, viermal. Für die SDS-Page-Analyse lagern Sie die SLO-Lösungen auf Eis. Bestimmen Sie die Protein-Konzentrationen und die hämolytische Aktivität; falls zufriedenstellend, portionieren Sie das SLOE in Fünf- bis Zehn-Mikroliter-Aliquots, gefrieren Sie es anschließend mit Trockeneis und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius.

Bestimmen Sie anschließend die spezifische Lyse. Reese. Suspendieren Sie die zu testenden Zellen in der zweifachen Konzentration. Zentrieren Sie sechs Zellen pro Milliliter in Puffer RB mit 20 Mikrogramm pro Milliliter.

Propidiumiodid. Hier werden T 27 A-Zellen getestet. Geben Sie 100 Mikroliter Zellen in jedes Loch einer 96-Loch-V-Boden-Platte in separaten Mikrozentrifugenröhrchen.

Verdünnen Sie SLO seriell auf die doppelte Endkonzentration in Puffer rb. Geben Sie anschließend entweder 100 Mikroliter Toxin oder 100 Mikroliter Puffer RB zu den Zellen und inkubieren Sie fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Typische Endkonzentrationen liegen zwischen 2000 Einheiten pro Milliliter und 31,25 Einheiten pro Milliliter.

Führen Sie die Zellen auf einem Durchflusszytometer und sammeln Sie die Daten mit Filtern für fi, cethrin oder pe. Eine logarithmische Verschiebung repräsentiert vorübergehend permeable Zellen, während eine dreifache logarithmische Verschiebung tote Zellen anzeigt. Berechnen Sie die spezifische Lyse der Zellen, indem Sie den Prozentsatz der toten Zellen in der Kontrolle von dem in der Versuchsgruppe mithilfe der hier gezeigten Gleichung subtrahieren, einen Tag vor den Experimenten plattieren Sie, zentrieren Sie zweimal die fünf Makrophagen auf kollagenbeschichtetem Glas.

Untere 35-Millimeter-Dishs. Das für die Toxinapplikation verwendete Mikroskop sollte mit einem invertierten Objekttisch, einem beheizten Objekttisch, den geeigneten Anregungs- und Emissions-Filterwürfeln sowie, falls verfügbar, einer Bertrand-Linse ausgestattet sein. Der schwierigste Teil dieses Verfahrens besteht darin, die Nadel intakt bis zu den Zellen herabzuführen.

Um den Erfolg sicherzustellen, verwenden wir eine Bertrand-Linse, die normalerweise zur Ausrichtung genutzt wird, um die Nadel sichtbar zu machen, während wir sie durch die Fokusebenen führen. Das Mikroskop sollte mit einem Mikroinjektor verbunden sein und von einem Computer mit ausreichendem Speicher gesteuert werden, um Daten sammeln und speichern zu können, das Mikroskop und den Mikroinjektor einzuschalten und dem beheizten Objektträger Zeit zu geben, sich auf 37 Grad Celsius aufzuwärmen, während man auf die Erwärmung des Objektträgers wartet. Markieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit Farbstoff bei 37 Grad Celsius.

Je nach Assay kann die Markierung mit fünf Mikrolitern, vier oder 2:00 Uhr morgens in einem Milliliter HBSS oder zwei Mikrolitern Calciumam in einem Milliliter vollständigem Medium hier erfolgen, wobei vier oder zwei verwendet werden. Entfernen Sie das Zellmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Aspirieren Sie das PBS und ersetzen Sie es durch ein Milliliter RPMI, ergänzt mit zwei Millimolar Calciumchlorid.

Bringen Sie die Petrischale unter dem Mikroskop in den Fokus mit Hellfeld, und stellen Sie dann leicht oberhalb der Zellen scharf. Mischen Sie anschließend einen Mikroliter SLO-Toxin mit vier Mikrolitern, 10 Milligramm pro Milliliter, DEXTRA 5 55 und sechs Mikrolitern Wasser. Zentrifugieren Sie danach bei 20.000 ×g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Dextran wird verwendet, um zu überprüfen, ob die Femtospitze nicht verstopft ist. Mit einem Mikrolader zwei Mikroliter verdünntes Toxin von hinten in die Femtospitze einladen. Die Femtospitze auf den Mikroinjektor aufsetzen.

Danach justieren Sie den Winkel des Injektors so, dass die Spitze über der Mitte der Zellen sitzt und genügend Bewegungsspielraum in alle Richtungen vorhanden ist. Löschen Sie die vorherigen Einstellungen für die Z-Begrenzung, die angibt, wie weit die Mikroinjektionsnadel nach unten fahren darf. Stellen Sie den Mikroinjektor so ein, dass er 0,5 Sekunden lang bei 120 PSI mit einem Gegendruck von 20 PSI injiziert. Senken Sie anschließend die Spitze ab, bis sie in das Medium eintaucht.

Verwenden Sie die Bertrand-Linse. Zentrieren Sie die Pipettenspitze und verfolgen Sie diese, während sie näher an die Zellen herangeführt wird. Sobald die Nadel außerhalb des Fokus gerät, schalten Sie zurück auf die normale Optik.

Der Nadel-Schatten sollte im Sichtfeld sichtbar sein. Fokussieren Sie oberhalb der Zellen und senken Sie die Nadel ab, bis sie scharf wird. Bringen Sie dann die Zellen in den Fokus und führen Sie die Nadel vorsichtig neben eine Zelle.

Nachdem die Z-Grenze für die Injektion festgelegt wurde, beginnen Sie mit der Bildaufnahme und injizieren das Toxin. Anschließend heben Sie die Nadel an und bewegen sich in einen neuen Zellbereich. Injizieren Sie weiteres Toxin und setzen Sie die Bildaufnahme nach der Injektion fort.

Bewegen Sie die Nadel in die Ausgangsposition, um unerwünschtes Austreten von Toxin aus der Nadel zu verhindern, wie in diesem Video beschrieben, 10 hoch sieben bis 10 hoch acht Einheiten pro Milliliter. SLO wird typischerweise mit einer Proteinkonzentration von vier Milligramm pro Milliliter erhalten. Dieses SDS-Page-Gel zeigt bakterielle Proben vor und nach Toxininduktion sowie nach anschließender Reinigung, und jede der drei Ellucian-Kamasi-Blau-Färbungen zeigt, dass das induzierte SLO erfolgreich gereinigt wurde.

SLO ist das Band bei 69 Kilodalton, um die Menge an Toxin zu bestimmen, die für die Lyse von T 27 A- oder D-Zellen erforderlich ist. Die Zellen wurden fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius verschiedenen Konzentrationen von SLO ausgesetzt, wobei Propidiumiodid vorhanden war, und mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die spezifische Lyse wurde wie hier gezeigt bestimmt.

250 Einheiten pro Milliliter. SLO verursacht eine 50%ige Lyse sowohl der T 27 A- als auch der D-Zellen. Eine sublytische Dosis von 10% Lyse würde 62,5 Einheiten pro Milliliter betragen.

Diese Werte sind wichtig, um die Toxinaktivität als Referenz zur Beurteilung des Zelltods nach Toxinexposition zu bestimmen. Menschliche dermale Fibroblasten wurden mit Calcium und Atherium-Homodimer unter Verwendung eines Live-Dead-Kits von Life Technologies inkubiert. Nach lokaler Exposition gegenüber dem bakteriellen Toxin Anthrolysin O. In diesem Bild ist Calcium grün dargestellt und Atheriumbromid in roten Bereichen nahe dem Mikrobiom, die Zelltod zeigen, gekennzeichnet durch Calciumverlust und Aufnahme des Athe-Homodimers, während Bereiche weiter entfernt von der Spitze keine Schädigung aufweisen.

Mithilfe der mikroskopischen Applikation des Toxins lässt sich auch die Untersuchung von Echtzeit-Ereignissen wie dem Kalzium-Fluss ermöglichen. Diese mit 4:02 AM beladenen humanen DCs wurden SLO bei einer konstanten Flussrate ausgesetzt, wobei gleichzeitig eine Live-Bildaufnahme eine Verschiebung von grün nach blau zeigte. Die Pseudofärbung deutet auf einen Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration hin.

SLO induziert einen schnellen Anstieg des zytosolischen Kalziums, der sich aufgrund der lokalisierten Applikation durch den Bereich der Petrischale ausbreitet. Allerdings kommen nur Zellen in unmittelbarer Nähe zur Mikroinjektionsspitze mit dem Toxin in Kontakt und reagieren darauf. Dies verdeutlicht sowohl die zelluläre Reaktion auf das Toxin als auch den räumlich begrenzten Bereich der Toxinapplikation, um Ereignisse in der z-Dimension aufzulösen.

Mikroinjektion wurde mit schneller 3D-Konfokalmikroskopie kombiniert. Dieser Bildersatz zeigt dendritische Zellen nach Toxininjektion. Sie wurden zuvor mit anti-CD11c, konjugiert mit einem PC, dargestellt in Grün, inkubiert, um die Plasmamembran zu markieren.

Wie hier zu sehen ist, werden Mikrovesikel nach der Toxinabgabe freigesetzt. Im Rahmen des zellulären Reparaturprozesses werden Toxinmoleküle auf Blebs angereichert, die abgeschnürt werden, um das Toxin zu eliminieren. Ist die Methode einmal beherrscht, kann die Mikroskopie innerhalb von 45 Minuten durchgeführt werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Toxin vor der Mischung mit den Zellen kalt zu halten und die hämolytische Aktivität zu testen. Gut. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Echtzeit-Kinetik der Immunzellantworten auf bakterielle Toxine mittels Live-Cell-Mikroskopie messen kann.