Models von Knochenmetastasen

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Tumorzellen so zu injizieren, dass ein Tumorwachstum im Knochen und anschließend eine Knochenzerstörung induziert wird. Dies wird erreicht, indem die Tumorzellen zunächst in kaltem PBS resuspendiert und auf Eis gegeben werden. Anschließend wird eine geeignete Anzahl von Zellen in den linken Herzkammer oder in die Tibia einer anästhesierten Maus injiziert.

Anschließend werden das Knochen­tumorwachstum und die Knochenparameter mittels mehrerer bildgebender Verfahren über einen längeren Zeitraum verfolgt. Schließlich erfolgt die quantitativen Endpunktmessungen der Tumor- und Knochenparameter. Letztendlich kommt eine Kombination aus in-vivo- und ex-vivo-Fluoreszenz- oder Lumineszenz-2D-Radiographie-3D zum Einsatz.

Mikro-CT und Histologie werden verwendet, um Tumorwachstum und Veränderungen im knöchernen Mikromilieu auf zellulärer und struktureller Wachstumsebene darzustellen. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen im Bereich der Krebsmetastasierung zu beantworten, beispielsweise, welche Faktoren im Knochen eine metastatische Besiedlung von Brust- und Prostatakrebs ermöglichen. Die Demonstration der Zellpräparation erfolgt durch Alisa Merkel, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin in meinem Labor. Kultivieren Sie die Zellen weniger als eine Woche lang.

Die Zellen, die den mit GFP markierten M-D-A-M-B-2-3-1-Klon in DMEM mit 10 % FBS und 0,1 Milligramm pro Milliliter enthalten, bei 37 Grad Celsius in 5 bis 8 % Kohlendioxid kultivieren; die Zellen bei 80 bis 90 % Konfluenz passagieren und im Verhältnis 1 zu 10 umsetzen. Zum Vorbereiten der Zellen für die Inokulation werden sie bei 80 bis 90 % Konfluenz mit 0,15 % Trypsin-EDTA unter Verwendung von 10 Milliliter abgelöst.

Kaltes DMEM mit 10 % FBS; die Zellen sofort in einen 50-Milliliter-Konischkolben überführen und fünf Minuten lang zentrifugieren. Den Zellpellet in einem 50-Milliliter-Konischkolben in 25 Milliliter kalter PBS ohne Calcium und Magnesium resuspendieren und die Zellen zählen. Die Zellen abzentrifugieren und in kalter PBS in einer Konzentration von 106 Zellen pro Milliliter für die intrakardiale Inokulation bzw. 250.000 Zellen pro Milliliter für die intratibiale Injektion resuspendieren.

Weibliche, immuninkompetente Mäuse im Alter von vier bis sechs Wochen, die fünf bis zehn Tage vor der Injektion mit einer Tela 29 20 x-Diät gefüttert wurden, werden für diese Experimente verwendet. Nach der Anästhesie des Mäuschens in einer Kammer mit 2,5 % Isofluran wird das Tier unter einer belüfteten Haube an eine Nasenkappe überführt und auf den Rücken gelegt. Die Brust wird mit einer 10 %igen Povidon-Jod-Lösung abgewaschen, gefolgt von 70 % Ethanol.

Markieren Sie die Brust der Maus für die Injektion in der Mitte zwischen dem Jugulum und dem oberen Ende des Xiphoidfortsatzes und leicht links vom Brustbein. Verwenden Sie danach eine 300 Mikroliter fassende Insulinspritze mit 28 Gauge und einer Nadellänge von einer halben Zoll. Ziehen Sie eine kleine Luftblase auf, um einen Raum zwischen dem Kolben und dem Meniskus zu schaffen, und ziehen Sie 100 Mikroliter Zellen auf, während Sie mit einer Hand die Haut der Maus straff halten.

Halten Sie die Nadel aufrecht und führen Sie sie ein. Ein erfolgreicher Einstich in den linken Herzkammer sollte zu einem deutlichen, hellroten Blutpuls in der Spritze führen. Verringern Sie bei dieser Tiefe vorsichtig den Kolben der Spritze, ohne die Nadel wesentlich zu bewegen, um ein Durchstechen des Herzens oder ein Verschütten von Zellen in die Brusthöhle zu vermeiden. Um das Tropfen von Zellen in die Brusthöhle zu reduzieren, ziehen Sie leicht am Kolben, um einen geringen Unterdruck zu erzeugen.

Ziehen Sie die Nadel dann direkt aus der Brust, wobei Sie darauf achten sollten, die Nadel während des Herausziehens nicht zu kippen, da dies die Herzinnenhaut reißen und Blutungen verursachen kann. Üben Sie etwa eine Minute lang sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um Blutungen zu verringern. Bewegen Sie die Maus beim Entfernen der Nasenkappe auf eine Heizplatte, bis sie vollständig bei Bewusstsein ist.

Kurz vor dem intratibialen Eingriff injizieren Sie der Maus Buprenex. Nachdem die Maus anästhesiert und in eine Nasenkonus-Anästhesievorrichtung gelegt wurde, reinigen Sie beide Beine mit 10% Povidon-Iod, gefolgt von Ethanol, unter Verwendung von vier Fingern und Daumen.

Greifen Sie sanft den lateralen und medialen Malleolus sowie die untere Hälfte der Tibia. Biegen Sie dann das Bein so, dass das Knie sichtbar und zugänglich ist. Benetzen Sie die Haut mit 70 %igem Ethanol, um die Sichtbarkeit des darunterliegenden Ligamentum patellae zu erhöhen, das als deutliche, dicke weiße Linie sichtbar sein sollte, während Sie den Knöchel festhalten.

Führen Sie eine 28-Gauge-Halbzoll-Nadel unter die Kniescheibe durch die Mitte des Ligamentum patellae in den vorderen Interkondylarbereich am oberen Ende der Tibia ein. Üben Sie gleichmäßigen, festen Druck mit einer leichten Bohrbewegung aus, um die Nadel vorsichtig durch die Wachstumsfuge zu führen. Sobald die Nadel die Wachstumsfuge der Tibia durchdringt, wird deutlich weniger Widerstand spürbar.

Verwenden Sie eine sanfte seitliche Bewegung der Nadel, um sicherzustellen, dass sie im Tibia und durch die Wachstumsfuge hindurch platziert ist. Die Beweglichkeit wird eingeschränkt sein, wenn die Nadel korrekt innerhalb der Tibia sitzt. Drücken Sie langsam den Kolben herunter, um 10 Mikroliter der Zellsuspension zu injizieren.

An dieser Stelle sollte kaum oder kein Widerstand spürbar sein. Ziehen Sie dann langsam die Nadel heraus. Entfernen Sie die Maus von der Anästhesie und halten Sie sie auf einer Heizplatte, bis sie sich erholt hat.

Überwachen Sie die Maus zwei- bis dreimal pro Woche. Bei anästhesierten Mäusen werden verschiedene bildgebende Verfahren wie Luciferase-, GFP-Fluoreszenz- und Röntgenuntersuchungen durchgeführt. Die Fluoreszenz zeigt Tumorareale an.

Mithilfe einer Estron-Scansuche werden Läsionen lokalisiert. Die Läsionen korrelieren mit den Fluoreszenzbildern. Weitere Einzelheiten zu den Bildgebungsverfahren finden sich im schriftlichen Teil dieses Protokolls.

21 bis 35 Tage nach der Injektion. Töten Sie die Mäuse mit einer iacuc-genehmigten Methode und lagern Sie die Knochen in 4 % Formalin. Führen Sie die Analyse ex vivo mittels Mikro-CT sowie der histomorphologischen Untersuchung mit Hämatoxylin- und DSN-Färbung an den isolierten Knochen durch. Einzelheiten finden Sie im schriftlichen Protokoll nach intrakardialer oder intratibialer Inokulation von Tumorzellen.

Mäuse werden wöchentlich mittels Röntgenaufnahmen sowie Fluoreszenz oder Lumineszenz überwacht. Läsionen werden normalerweise zwischen der zweiten und dritten Woche im Röntgenbild sichtbar. Obwohl sie je nach Modell, wie hier gezeigt, bereits ab der zweiten Woche mittels Fluoreszenz und Lumineszenz erkennbar sein können, erscheinen die Läsionen als dunkle Löcher im Knochen und können sich im Verlauf der Zeit verstärken. Die Läsionen wurden mittels Metamorph-Analyse von Röntgenaufnahmen und Fluoreszenzbildern quantifiziert.

Wurden mit der Maestro-Bildaufnahme- und Analyse-Software quantifiziert. In dieser Abbildung wird der Knochenverlust mittels Mikro-CT-Analyse quantifiziert. Knochenstrukturelle und mineralische Daten aus Mikro-CT-Messungen werden als 3D-Bilder von gesundem Knochen und von einem tumorbehafteten Knochen dargestellt, wobei Bereiche der Knochenzerstörung als Hohlraum sichtbar sind.

Die histomorphometrische Geometrie wurde anschließend an den Proben durchgeführt, um die Tumormasse sowie das Knochenvolumen im Verhältnis zum Gesamtvolumen des Gewebes zu bestimmen. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, geduldig vorzugehen und jedes Tier sorgfältig zu positionieren sowie die Mäuse genau zu überwachen. Falls die Tiere zu sterben beginnen, liegt dies wahrscheinlich an Zellagglomerationen, und Sie sollten unverzüglich neue Zellen vorbereiten.

Das Schlimmste, was Sie tun können, ist, die Verfahren zu überstürzen oder frustriert zu werden. Denken Sie daran, mit mehr Übung und Zeit werden Sie im Anschluss an ihre Entwicklung besser und schneller. Diese Techniken ebneten Krebsforschern den Weg, Knochenmetastasen in vivo zu untersuchen.