Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye
25. November 2012
Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.
Der erste Schritt besteht darin, das Gerät aus einem Blutentnahmeset zusammenzustellen. Schneiden Sie eine Nadel mit 25 und drei Viertel Gauge aus diesem acht Zentimeter langen Stück steriler Schlauchleitung ab. Mit einem Luer-Lock können Sie eine Glas-Kapillarnadel mit einem Durchmesser von hundert Mikrometern erwerben oder selbst mit einem Sutter-P-97-Pipettenzieher herstellen und anschließend sterile Kochsalzlösung aufsaugen, um den Totraum in der Schlauchleitung zu füllen.
Verbinden Sie ein Glas-Kapillarrohr mit dem Ende des sterilen Kunststoffschlauchs und geben Sie etwas Kochsalzlösung durch die Nadel ab, um sicherzustellen, dass die Verbindung dicht ist und kein Flüssigkeitsaustritt auftritt. Untersuchen Sie unter dem Mikroskop, wie viel Druck angewendet wird und mit welcher Geschwindigkeit die Flüssigkeit durch die feine Spitze austritt. Wir verwenden eine gefärbte Lösung, um den viralen Vektor oder die Stammzellen darzustellen. Geben Sie diese in eine sterile Petrischale, saugen Sie etwas Luft an und danach die Injektionslösung.
Für unsere Zwecke verwenden wir P fünf Mäuse. Auf diesem Bild sehen Sie die Schnauze. Die Lage des Auges ist durch ein Augenlid bedeckt.
Die gestrichelten Linien zeigen den Lidrand und die Lidfalte an, an denen der Schnitt durchgeführt wird. Mit geraden Vanis-Scheren wird ein anderthalb Millimeter langer Schnitt entlang des geschlossenen Lids angelegt. Mit Spaltquetschen werden die Augenlider auseinandergezogen und das Auge nach vorne gedrückt, sodass der Lidrand leicht hinter dem Augapfel liegt.
Um die Sklerotomie durchzuführen, ist es wichtig, einige Orientierungspunkte erkennen zu können. Der Übergang von der klaren Hornhaut zur Sklera wird durch den Limbus markiert. Direkt innerhalb der Sklera befindet sich das retinale Pigmentepithel, danach die Retina und anschließend das Glaskörper-Matomy, das zur Hälfte zurückliegt oder am Äquator der Augapfel-Inzision platziert wird, indem die Oberfläche mit einer 15-Grad-mikrochirurgischen Klinge angeritzt wird, insbesondere bei dunkel pigmentierten Tieren.
Ein dunkelbraunes, pigmentiertes Gewebe wird an der Stelle des Einschnitts sichtbar werden. Wenn der Einschnitt zu weit durchgeführt wird, sehen Sie tatsächlich, wie Flüssigkeit austritt. Dies stellt das Glaskörper dar, und bedeutet, dass Sie zu tief geschnitten haben.
Das retinale Pigmentepithel passieren. Dieser Einschnitt könnte für eine intravitreale Injektion verwendet werden. Nun das Versuchstier.
An dieser Stelle ist der Einschnitt vollständig. Weitere Einschnitte und Kratzer ermöglichen die Freisetzung des Glaskörpers für eine subretinale Injektion. Das Ziel besteht darin, das mikroskopische Kapillarrohr in den subretinalen Raum einzuführen, direkt zwischen Netzhaut und Pigmentepithel (RPE). War der Einschnitt zu tief, kann die Nadel durch die Netzhaut hindurch in den Glaskörper vorgeschoben werden. Führen Sie die Nadel parallel zur äußeren Augenwand ein.
Um einen subretinalen Raum zu erreichen. Üben Sie leichten Druck auf den Kolben aus und beginnen Sie mit der Injektion der Flüssigkeit. Wenn die Nadel korrekt positioniert ist, wird ein mäßiger Gegendruck spürbar sein und eine BLE im subretinalen Raum entstehen.
Befindet sich die Nadel im Glaskörper, ist der Gegendruck deutlich geringer. Um einen erheblichen Reflux zu vermeiden, halten Sie den Kolben nach der Injektion weitere 15 Sekunden lang in Position, bevor Sie die Nadel entfernen. Dies ermöglicht es, dass sich der Augeninnendruck stabilisiert.
Schieben Sie das Auge vorsichtig mit einer gebogenen Tupferzange wieder hinter die Augenlider in die Augenhöhle zurück. Hier sehen Sie ein weiteres Beispiel einer subretinalen Injektion, bei der sich der Farbstoff im subretinalen Raum ausbreitet und bei einem albino-Tier deutlich sichtbar ist. Der Luftmeniskus ermöglicht es Ihnen, zu erkennen, wann die Injektion beendet ist.
Flüssigkeitsinjektionen in ein stark pigmentiertes Auge sind etwas anspruchsvoller. Durch die sorgfältige Einführung der Nadel können hervorragende Ergebnisse erzielt werden.
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Übersicht
Diese chirurgische Technik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Mausauges. Das Verfahren beinhaltet die sorgfältige Zusammenstellung eines Geräts zur präzisen Applikation der therapeutischen Wirkstoffe.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Gentherapie
- Stammzellforschung
- Augenheilkunde
Hintergrund
- Die Gentherapie zielt darauf ab, Krankheiten durch die Einführung genetischen Materials in Zellen zu behandeln oder zu verhindern.
- Stammzellen besitzen das Potenzial, geschädigtes Gewebe zu regenerieren.
- Der subretinale Raum ist ein entscheidender Bereich für okulare Eingriffe.
- Mausmodelle werden häufig für präklinische Studien in der Sehforschung verwendet.
Zweck der Studie
- Eine chirurgische Technik zur Verabreichung von Vektoren der Gentherapie demonstrieren.
- Das Potenzial von Stammzellen bei der Behandlung von Netzhauterkrankungen untersuchen.
- Methoden zur präzisen Injektion in das Auge verfeinern.
Verwendete Methoden
- Zusammenbau eines Geräts aus einem Blutentnahmeset.
- Vorbereitung einer Glas-Kapillarnadel für die Injektion.
- Aufziehen steriler Kochsalzlösung, um das Gerät zu füllen.
- Verwendung einer farbigen Lösung, um den viralen Vektor oder die Stammzellen während des Verfahrens darzustellen.
Hauptergebnisse
- Das Gerät ermöglicht eine kontrollierte Injektion in den subretinalen Raum.
- Erfolgreiche Visualisierung der Flüssigkeitsausstoßung unter dem Mikroskop.
- Veranschaulichung der Machbarkeit der Technik für Anwendungen in der Gentherapie.
- Mögliche Implikationen für zukünftige Behandlungen von Netzhauterkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Diese Technik bietet eine zuverlässige Methode für die Gen-Therapie-Abgabe.
- Weitere Studien sind erforderlich, um die Langzeitergebnisse zu bewerten.
- Sie eröffnet neue Ansätze für innovative Behandlungen von Netzhauterkrankungen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese chirurgische Technik ermöglicht die gezielte Applikation von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum von Augen perinataler Mäuse und unterstützt so die präklinische Validierung okularer Therapeutika. Durch die Minimierung von Gewebeschäden und eine präzise Zielgerichtetheit verbessert das Verfahren die Reproduzierbarkeit in frühen Entdeckungsphasen bei Modellen retinaler Erkrankungen. Es bietet eine skalierbare Plattform zur Bewertung therapeutischer Kandidaten, bevor diese in Studien an größeren Tierarten oder in forschungsvorbereitenden Arbeiten zur Zulassung (IND) eingesetzt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die funktionelle Untersuchung von Gentherapiekonstrukten in einem krankheitsrelevanten okularen Mikromilieu.
- Operativer Wert: Unterstützt die Target-Validierung, indem die Abgabe an die beabsichtigten Netzhautschichten bestätigt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Messwerte zur Verteilung von Vektoren oder Zellen mittels sichtbarer Bläschenbildung im subretinalen Raum.
- Operativer Wert: Standardisiert Injektionsparameter für reproduzierbare Dosierung von Substanzen oder Zellen über verschiedene Studienkohorten hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Risiken durch eine longitudinale Beurteilung der Einwanderung oder Expression in perinatalen Modellen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die Durchführung von Dosis-Wirkungs-Tests, die für die präklinische Sicherheits- und Wirksamkeitscharakterisierung entscheidend sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode ist in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Bewertung integrierbar, insbesondere für okulare Gen- und Zelltherapien.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft Hypothesen bezüglich Vektor-Tropismus, Promotoraktivität oder Stammzell-Einlagerung in der retinalen Nische.
- Screening: Appliziert standardisierte Volumina therapeutischer Wirkstoffe, um vergleichende Tests von Kandidaten zu ermöglichen.
- Analytik: Liefert visuelle und räumliche Messgrößen (z. B. Blasengröße, Fluoreszenz), um den Erfolg der Applikation zu quantifizieren.
- Translationale Forschung: Verbindet Grundlagenforschung und präklinische Studien, indem die Applikation in einem physiologisch relevanten neonatalen Augenmodell validiert wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare chirurgische Plattform für die iterative Prüfung mehrerer Vektoren oder Zelllinien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Zielstrukturenbindung, indem die subzelluläre Lokalisation applizierter Wirkstoffe bestätigt wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Gerätemontage und Injektionstechnik.
- Strategischer Wert: Verringert biologische Entwicklungsrisiken, indem eine frühe funktionelle Validierung in vivo ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf Metriken zur Abgabeeffizienz und zum Gewebefortschritt.
Durchführungsaspekte
- Erfordert mikrochirurgische Fachkenntnisse und Vertrautheit mit der okularen Anatomie neonataler Tiere.
- Benötigt präzise Instrumente wie mikrochirurgische Klingen, Pinzetten und Werkzeuge zur Herstellung von Glas-Kapillaren.
- Setzt eine standardisierte Schulung voraus, um die Variabilität der Einschnitttiefe und Nadelplatzierung zwischen verschiedenen Operateuren zu minimieren.
- Muss pigmentationsbedingte Sichtbarkeitsprobleme berücksichtigen, wenn die Methode auf verschiedene Mausstämme angepasst wird.
- Eingeschränkt durch die technische Fertigkeit, die erforderlich ist, um eine Penetration des Glaskörpers zu vermeiden und eine subretinale Platzierung sicherzustellen.
