Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen
29. Dezember 2012
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Aktivierung und Ausbau menschlichen NKT-Zellen aus losem T-Zellpopulationen mit künstlichen Antigen-präsentierende Zellen (AAPC). Die Verwendung von CD1d basierenden AAPC bietet eine standardisierte Verfahren zur Erzeugung hoher Anzahl funktioneller NKT-Zellen.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, CD1D-basierte künstliche antigenpräsentierende Zellen oder A APC zur Expansion von NK-T-Zellen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst Proteine hinzugefügt werden, um die magnetischen Kügelchen zu funktionalisieren. Im zweiten Schritt wird die initiale Population der NK-T-Zellen aus dem peripheren Blut angereichert.
Anschließend werden die angereicherten T-Zellen gemeinsam mit den A A PC kultiviert. Im letzten Schritt werden Phänotyp und Funktion der A A PC-Zellpopulation bewertet. Letztendlich kann die Reinheit der expandierten T-Zell-Subpopulationen mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden. Der Hauptvorteil von a PCs gegenüber aktuellen Methoden, die dendritische Zellen verwenden, liegt darin, dass bei dendritischen Zellen eine hohe Spender-Variabilität auftreten kann.
APCs bieten eine reproduzierbare, kommerziell verfügbare und standardisierte Methode zur Expansion von NK-T-Zellen. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als ich mit Dr. Schneck und Oaky an der Johns Hopkins arbeitete. Sie haben das Gebiet der Verwendung künstlicher antigenpräsentierender Komplexe zur Expansion klassischer CD8-T-Zell-Subsets maßgeblich vorangebracht.
Den Ablauf wird Dr. James East, ein Postdoktorand, und Dr. Wendys Sohn demonstrieren. Ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor beginnt damit, ein Milliliter DynaBead M-450-Epoxyperlen in ein fünf Milliliter fassendes klares Borosilikatglasgefäß mit Gewinde zu überführen. Anschließend werden die Perlen mit drei Milliliter sterilem Bore-acht-Puffer in einem separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen gespült.
Fügen Sie 100 Mikrogramm humanen CD1D-Ig-Dimers und 20 Mikrogramm der gewünschten kostimulatorischen Moleküle zu einem Milliliter kalzium- und magnesiumfreier PBS hinzu. Stellen Sie anschließend das Glasröhrchen mit den Perlen auf einen Magneten und aspirieren Sie den Boratpuffer. Geben Sie dann das Protein-Gemisch zum Glasröhrchen hinzu und verschließen Sie es mit dem Deckel.
Mischen Sie die Lösung sofort, indem Sie das Gefäß umdrehen, decken Sie danach die Kappe mit Parafilm ab und stellen Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. Stellen Sie das Glasgefäß am nächsten Tag erneut auf den Magneten und entfernen Sie vorsichtig die Proteinmischung, wobei Sie die Kügelchen vermeiden sollten. Waschen Sie die Kügelchen dreimal, indem Sie jeweils drei Milliliter Kügelchen-Waschpuffer hinzufügen und fünf Minuten bei vier Grad Celsius auf dem Rotator inkubieren.
Um zu bestätigen, dass die Proteine stabil auf die Kügelchen aufgebracht sind, färben Sie eine Aliquotprobe der Kügelchen mit Antikörpern und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie. Überführen Sie nun fünf mal 10 hoch sieben Kügelchen in ein kleines 1,5-Milliliter-Gläschen und waschen Sie die Kügelchen mit einem Milliliter steriler PBS. Lagern Sie sie dann 48 bis 72 Stunden vor der Verwendung.
Beladen Sie die gewaschenen Kügelchen mit Antigen in einem Milliliter steriler PBS, während die Kügelchen mit Antigen beladen werden. Sammeln Sie die PBMC, indem Sie zunächst das heparinisierte Spenderblut mit einem gleichen Volumen PBS bei Raumtemperatur verdünnen. Fügen Sie dann 15 Milliliter PHI bei Raumtemperatur hinzu, geben Sie die Mischung in 50-Milliliter-Konischflaschen und überlagern Sie langsam 25 Milliliter der verdünnten Blutmischung auf das PHI.
Rufen Sie anschließend die Proben nach einer Zentrifugation für 30 Minuten bei 700 × g und Raumtemperatur mit Abbremsung ab. Übertragen Sie die Lymphozyten-Schnittstelle vorsichtig mit einer Pasteurpipette in ein neues kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie danach die Lymphozyten in 50 Milliliter PBS, entfernen Sie den Überstand und vereinigen Sie die Röhrchen einer einzelnen Spenderin bzw. eines einzelnen Spenders in einem einzigen Röhrchen.
Nachdem die PBMC erneut mit 20 Milliliter PBS gewaschen wurden, zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie anschließend in Max-Puffer mit einer Konzentration von fünf mal 10 hoch sieben Zellen pro Milliliter. Zur Isolierung der T-Zell-Fraktion inkubieren Sie 100 Mikroliter PAN-T-Zell-Anreicherungslösung aus dem EP-Human-T-Zell-Anreicherungs-Kit mit zwei Milliliter PBMC 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend inkubieren Sie die Lösung mit 100 Mikroliter magnetischen Kügelchen 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Bringen Sie das endgültige Volumen des Lösungsmittels auf 2,5 Milliliter und stellen Sie das Röhrchen dann auf das Magnet. Nach fünf Minuten gießen Sie den CD3-positiven Anteil schnell in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen ab. Waschen Sie die Zellen nun mit fünf Milliliter kaltem Max-Puffer und zählen Sie die lebensfähigen Zellen.
Entnehmen Sie eine Aliquotprobe für die FACS-Färbung, um zunächst die CD161-positiven Zellen auszuwählen. Resuspendieren Sie die angereicherten T-Zellen in 980 Mikroliter eiskaltem Max-Puffer und inkubieren Sie die Zellen anschließend 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit 10 Mikrogramm anti-CD161 monoklonalem Antikörper. Nach dem Waschen der Zellen resuspendieren Sie das Pellet in 800 Mikroliter Max-Puffer und 200 Mikroliter anti-US-IgG1-Mikroperlen.
Inkubieren Sie diese Lösung weitere 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Während die Zellen mit den Mikroperlen inkubieren, geben Sie drei Milliliter Max-Puffer hinzu, um eine LS-Säule zu equilibrieren. Nach dem Waschen dieses Zellanteils pipettieren Sie langsam die Zellen in drei Milliliter Max-Puffer in die Säule.
Spülen Sie die Säule nun dreimal mit je drei Milliliter frischem Max-Puffer. Geben Sie anschließend weitere drei Milliliter frischen Max-Puffer auf die Säule und übertragen Sie die Säule in ein 15-Milliliter-Kegelröhrchen. Eluieren Sie die gereinigten CD161-positiven, CD3-positiven Zellen und zählen Sie danach den angereicherten NKT-Zell-Fraktion.
Beginnen Sie diesen Schritt mit der Kokultivierung von 10 hoch 6 angereicherten CD161-positiven, CD3-positiven T-Zellen und 10 hoch 6 AA-PC in 16 Millilitern vollständigem Kulturmedium. Pipettieren Sie 160 Mikroliter pro Vertiefung der Kokultur in eine 96-Loch-Gewebe-Kultur-Platte aus polystyrolbeschichtetem U-Boden mit niedriger Verdunstungskappe. Am Tag 12 bis 14 ernten und zählen Sie die Zellen. Analysieren Sie die Populationen mittels Durchflusszytometrie und pflanzen Sie anschließend erneut aus und führen Sie die Kokultivierung durch.
Die expandierten NKT-Zellen, wie gerade gezeigt, frieren Sie die zusätzlichen NKT-Zellen nach der zweiten Expansion ein. Um die Funktionalität der A A PC-Zellen zu testen, koinkubieren Sie zunächst 5 × 10⁴ NKT-Zellen pro Vertiefung mit 5 × 10⁵ A A PC in einem Endvolumen von 200 µL komplettem Medium in einer 96-Loch-Platte mit flachem Boden. Nach 24 bis 48 Stunden gewinnen Sie den Zellkulturüberstand zur Analyse mittels ELISA. Diese erste Abbildung zeigt, dass die CD1d-Ig-Proteine stabil auf der Oberfläche der magnetischen Kügelchen immobilisiert sind, wie hier dargestellt.
CD1D-Ig- und Anti-CD28-Antikörper sind beide auf der Oberfläche der magnetischen Kügelchen exprimiert, wie in dieser Grafik gezeigt. Das Vα14-positive murine NK-T-Zell-Hybridom DN3A2-D3 wurde entweder mit mittellöslichem, unbeladenem α-GalCer-Antigen, unbelegten AA-PC oder mit α-GalCer-beladenen AA-PC koinkubiert. Anschließend wurden die Kulturüberstände gewonnen und die IL-2-Produktion mittels ELISA gemessen, was eine einfache Methode zur Prüfung jeder Charge von antigenpräsentierenden Zellen darstellt. In diesem Experiment wurden humane CD161-positive, CD3-positive periphere Blut-T-Zellen mittels magnetischer Kügelchenanreicherung angereichert.
Die Zellen wurden anschließend einmal pro Woche über einen Zeitraum von 14 Tagen mit Alpha-Galera-beladenen A A PC stimuliert und auf die Expression von V alpha 24 und V beta 11 analysiert. Wichtig ist, dass selbst bei einer relativ geringen anfänglichen NKT-Zellpopulation von 0,03 % eine Expansion auf etwa 67 % V alpha 24-positiver und V beta 11-positiver Zellen erreicht werden konnte. Hier wurden C ein R CD 1D-Zellen mit NKT-Zellen in den angegebenen Verhältnissen in An- oder Abwesenheit von Alpha Gal SER-Antigen in 96-Well-U-Boden-Platten für 20 bis 24 Stunden inkubiert.
Die von NKT-Zellen vermittelte Zelllyse der B-Zell-Lymphomlinie wurde anschließend mittels Chromfreisetzungsassay bewertet. A A PC-erweiterte NKT-Zellen konnten diese Lymphomzelllinie lysieren. In Gegenwart oder Abwesenheit von Alpha-Galactosylceramid wurden NKT-Zellen aus PBMCs sowohl gesunder Spender als auch Krebspatienten expandiert und mit Alpha-Galactosylceramid beladen.
A A PC konnten die NKT-Zellpopulationen aus beiden Gruppen erfolgreich expandieren. Bei Verwendung einer Startpopulation von 2 Millionen CD161-positiven, CD3-positiven T-Zellen können nach zwei Expansionsrunden mehr als 107 Zellen erhalten werden. Die expandierten NKT-Zellen können für funktionelle Untersuchungen verwendet werden, wie hier gezeigt.
Die ex vivo expandierten NKT-Zellen bleiben ansprechbar auf Alpha-Gal-Stimulation und produzieren weiterhin hohe Mengen an IL-17A, TNF-alpha und Interferon-gamma. Es sollte beachtet werden, dass, wenn die anfängliche T-Zell-Anreicherungspopulation gering ist und der zweite Anreicherungsschritt über CD161 nicht durchgeführt werden kann, die durch APC vermittelte Expansion möglicherweise nicht die erwarteten Ergebnisse liefert. Wenn jedoch der Prozentsatz zirkulierender NKT-Zellen höher als 0,1 % ist, sollte dennoch eine signifikante Expansion invarianter NKT-Zellen erzielt werden können.
Insgesamt zeigen diese Daten, dass die auf CD1D-basierende AAPC dazu verwendet werden kann, primäre humane NKT-Zellen effektiv zu expandieren und zu stimulieren, nachdem dieses Verfahren angewendet wurde. Andere Methoden wie die QPCR können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise nach der Kinetik der NKT-Zellaktivierung nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Hepatologie den Weg, um die Rolle von NKT-Zellen bei der Fettlebererkrankung zu untersuchen.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Aktivierung und Expansion menschlicher NKT-Zellen aus Gesamt-T-Zellpopulationen unter Verwendung künstlicher antigenpräsentierender Zellen (aAPC) beschrieben. Die standardisierte Anwendung von auf CD1d basierenden aAPC ermöglicht die Erzeugung großer Mengen funktioneller NKT-Zellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Immunologie
- Zellbiologie
- Translationale Medizin
Hintergrund
- NKT-Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei den Immunantworten.
- Aktuelle Methoden, die dendritische Zellen verwenden, weisen eine hohe Spender-Variabilität auf.
- aAPCs bieten einen reproduzierbaren und standardisierten Ansatz.
- Bisherige Arbeiten haben die Verwendung künstlicher antigenpräsentierender Komplexe etabliert.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Expansion von NKT-Zellen aus peripherem Blut entwickeln.
- CD1d-basierte aAPZs zur Erzielung konsistenter Ergebnisse verwenden.
- Die Funktionalität und Reinheit expandierter T-Zell-Subpopulationen bewerten.
Verwendete Methoden
- Funktionalisierung magnetischer Kügelchen mit Proteinen.
- Anreicherung initialer NKT-Zellpopulationen aus peripherem Blut.
- Kokultivierung angereicherter T-Zellen mit aAPCs.
- Durchflusszytometrische Analyse zur Beurteilung von Zellphänotyp und -funktion.
Hauptergebnisse
- Es wurden hohe Zahlen funktioneller NKT-Zellen erfolgreich generiert.
- Die Methode zeigte Reproduzierbarkeit über verschiedene Spender hinweg.
- Die Durchflusszytometrie bestätigte die Reinheit der expandierten NKT-Zellen.
- Funktionelle Assays zeigten die Wirksamkeit der aAPCs an.
Schlussfolgerungen
- CD1d-basierte aAPCs sind ein zuverlässiges Werkzeug zur Expansion von NKT-Zellen.
- Diese Methode kann die Forschung in der Immuntherapie voranbringen.
- Zukünftige Studien könnten weiterreichende Anwendungen von aAPCs untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Branchenrelevanz
Künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPC) beheben die Spendervariabilität bei der dendritischen Zell-vermittelten Expansion von NKT-Zellen und ermöglichen die reproduzierbare Herstellung funktioneller NKT-Zellen für die Immuntherapieforschung. Dieses standardisierte System unterstützt die Zielvalidierung und präklinische Modellierung, indem es eine skalierbare, direkt verfügbare Plattform zur Generierung invarianter NKT-Zellen (iNKT-Zellen) mit konsistentem Phänotyp und zytotoxischer Funktion bereitstellt. Die Methode erhöht die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Entdeckungsforschung, indem sie biologisches Rauschen verringert, das mit der Variabilität autologer antigenpräsentierender Zellen assoziiert ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Lipidantigenpräsentation über CD1d zur mechanistischen Absicherung von NKT-Zell-vermittelten Immunantworten.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares System zur Isolierung und Expansion invarianter NKT-Zellen aus peripherem Blut, das konsistente Untersuchungen zur Targetbindung unterstützt.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die funktionelle Validierung der NKT-Zell-Zytotoxizität gegenüber Tumorzelllinien und trägt so zur Bewertung der Zielhypothesensicherheit für Immuntherapiekandidaten bei.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt expandierte NKT-Zellen, die für Screenings mit hohem Informationsgehalt bezüglich immunmodulatorischer Substanzen oder Zytokinspektren geeignet sind.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte aAPC-Präparationen, die die Reproduzierbarkeit von Assays über verschiedene Spender und experimentelle Ansätze hinweg gewährleisten.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht quantitative Messgrößen wie die Sekretion von IFN-γ, TNF-α und IL-17A für die assaynahe Entwicklung im Einklang mit Biomarkern.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Modellierung krankheitsrelevanter Systeme durch die Expansion von NKT-Zellen sowohl von gesunden Spendern als auch von Krebspatienten für präklinische Funktionsuntersuchungen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht Expansionsprotokolle in zwei Runden, um ausreichende Zellzahlen (>10⁷) für nachgeschaltete Anwendungen wie Chromfreisetzungsassays oder Zytokine-Profilierung zu erhalten.
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Funktionalität der NKT-Zellen nach der Expansion und bewahrt deren Ansprechen auf α-GalCer-Stimulation sowie die Kapazität zur Zytokinproduktion für eine translationale Kontinuität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die aAPC-Methode integriert sich in den Entdeckungsworkflow von der frühen Target-Validierung bis hin zur präklinischen Validierung und ermöglicht die skalierbare Produktion von NKT-Zellen zur Voranbringung der Immuntherapie-Pipeline.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu CD1d-Lipid-Antigen-Wechselwirkungen und NKT-Zell-Aktivierungskinetik durch standardisierte aAPC-Stimulation.
- Screening: Stellt testtaugliche NKT-Zellen mit definierten Vα24⁺Vβ11⁺-Phänotypen für Substanz-Screenings und Zytokinausschuss-Profilierung bereit.
- Analytik: Ermöglicht die durchflusszytometrische und ELISA-basierte Quantifizierung von Aktivierungsmarkern und Zytokinausschüben zur vergleichenden Bedingungsanalyse.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem funktionelle NKT-Zellen erzeugt werden, die in krankheitsrelevanten Kontexten Tumorzellen lysieren und Zytokine sezernieren können.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert aAPC als wiederverwendbare Plattformtechnologie, die die Abhängigkeit von variablen, spendenderived dendritischen Zellen über verschiedene Projekte hinweg reduziert.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagbare Zuverlässigkeit der NKT-Zellfunktion durch standardisierte Aktivierung und Expansion, wodurch mechanistische Unschärfen bei der Validierung immuntherapeutischer Zielstrukturen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Hohe Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch die Verwendung von standardisierten, kommerziell verfügbaren aAPCs, wodurch die Variabilität zwischen Chargen minimiert wird.
- Strategischer Wert: Verbesserte Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der Immuntherapieentwicklung, da biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien aufgrund inkonsistenter Zellprodukte verringert werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von NKT-gerichteten Therapien basierend auf reproduzierbaren präklinischen Wirksamkeitsdaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der immunmagnetischen Zellseparation und Durchflusszytometrie zur Anreicherung und phänotypischen Validierung von NKT-Zellen.
- Setzt den Zugang zu Geräten für die Funktionalisierung magnetischer Mikrokügelchen, Protein-Konjugationsreagenzien und steriler Zellkulturausstattung voraus.
- Erfordert die Standardisierung von aAPC-Beladungsprotokollen (z. B. α-GalCer und kostimulatorische Moleküle) über verschiedene Standorte hinweg, um eine konsistente Leistung zu gewährleisten.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Titration des Verhältnisses von aAPC zu NKT-Zellen sowie der Bedingungen für die Antigenbeladung bei unterschiedlichen Ausgangsfrequenzen der Spenderzellen.
- Praktische Einschränkung: Die Expansionsleistung kann abnehmen, wenn die anfängliche NKT-Zellfrequenz unter 0,03 % liegt oder die Anreicherung von CD161⁺CD3⁺-Zellen fehlschlägt, was eine Optimierung der Eingangszellqualität erfordert.
