Appetitive Assoziative olfaktorischen Lernens in

Das Ziel dieses Verfahrens ist die Analyse höherer Hirnfunktionen. In einem einfachen Modell erfolgt dies an DFA-Larven mittels Appetit und assoziativem olfaktorischem Lernen. Dies wird erreicht, indem zunächst 30 sättigungsstarke Larven im dritten Larvenstadium aus einem Nahrungsröhrchen gesammelt werden.

Anschließend werden die Larven fünf Minuten lang in einer Petrischale mit Fructose als Belohnung und je einem Geruchbehälter auf jeder Seite trainiert, wobei ein Octanol als olfaktorischer Stimulus dient. Danach erfolgt eine zweite Trainingsphase von fünf Minuten Dauer auf einer Schale ohne Fructose-Belohnung und mit Geruchbehältern auf beiden Seiten, die Amylacetat enthalten. Nach drei Wiederholungen der beiden Trainingsphasen werden die Larven einem fünfundzwanzigminütigen Test mit gegenüberliegenden Geruchbehältern ohne Belohnung ausgesetzt.

Letztlich zeigt die relative Geruchspräferenz eines Octals gegenüber Amalacetat, dass Drosophila-Larven eine Assoziation zwischen olfaktorischen Reizen und einer zuckerbasierten Belohnung eingehen können, was zur Untersuchung assoziativen Lernens in einem genetisch modulierbaren System genutzt werden kann. Diese Methode in Kombination mit genetischer Störung der neuronalen Funktion kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Lernen und Gedächtnis zu beantworten, beispielsweise welche Neuronen das Belohnungssignal vermitteln oder welche Neuronen notwendig oder ausreichend für die Bildung beziehungsweise den Abruf eines wiederholten Gedächtnisses sind. Die Durchführung des Verfahrens wird Anti A Postop demonstrieren.

Ein Doktorand aus meinem Labor stellt zunächst 2,5 % aros-Petri-Schalen ohne Fructose her. Um die Fructose-Schalen herzustellen, wird die Fructose dem gelösten aros zugegeben und anschließend die Mischung in die Schale gegossen. Danach wird jede dieser Schalen mit einem anderen Symbol gekennzeichnet, um den Experimentator zu blenden.

Die mit Fructose versetzte Schale ist die belohnende Bedingung, und die unveränderte Schale ist die Nicht-Belohnung. Für die konditionierten Reize bereiten Sie insgesamt drei individuell angefertigte Teflon-Gefäße für Gerüche mit je 10 µL reiner One-Octal vor. Die Deckel weisen kleine Löcher auf, um die Verdunstung des Geruchs zu ermöglichen.

Zweitens bereiten Sie drei weitere Duftgefäße mit je 10 Mikrolitern Amylacetat vor, die im Verhältnis 1:50 in Paraffinöl verdünnt sind. Diese Verdünnung ist ebenso attraktiv wie 10 Mikroliter reines Amylacetat. Beginnen Sie damit, 30 Tiere zu sammeln, zu füttern und sicherzustellen, dass sie nicht umherwandern. Drittens von einem Nahrungsgefäß entfernt.

Dieses Protokoll kann zu jeder Tageszeit durchgeführt werden. Es ist unabhängig von circadianen Rhythmen. Überführen Sie die Lava in eine Petrischale, die einige Tropfen Leitungswasser enthält, und bewegen Sie sie vorsichtig mit einem Pinsel vorwärts und rückwärts.

Überführen Sie dann die Larven in eine zweite Petrischale, die ebenfalls einige Tropfen Leitungswasser enthält. Untersuchen Sie die Larven auf Futterpaste an ihren Körperwänden. Stellen Sie nun die Petrischale in die Versuchsapparatur, um die Larven darin zu trainieren, Gerüche mit einer bestimmten Zuckerquelle zu assoziieren.

Stellen Sie einen Duftbehälter auf die linke und rechte Seite einer der beiden Arten von Schalen, die für die Reize verwendet werden. Hier wird eine oktale verwendet, aber die Wahl ist beliebig, da der Versuchsleiter bezüglich der Belohnung geblendet ist. Danach platzieren Sie die Gruppe der Thi-Larven in die Mitte der Schale.

Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten, während die Tiere den Stimuli ausgesetzt sind. Stellen Sie sicher, dass die Larven die Oberflächenspannung des Wassertropfens überwinden können, damit sie nicht eingeschlossen sind und sich frei bewegen können. Setzen Sie einen neuen Behälter mit Amalacetat auf eine frische Petrischale.

Nach fünf Minuten verwenden Sie einen feuchten Pinsel, um die Larven auf eine andere Art von Schale zu übertragen, auf deren linker und rechter Seite sich jeweils der entgegengesetzte Reiz befindet. Der Geruch hier ist Amalacetat. Sobald die Larven übertragen wurden, schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Tiere fünf Minuten lang erkunden.

Wenn diese Zeit abgelaufen ist, ist die erste Trainingseinheit abgeschlossen. Führen Sie zwei weitere Trainingseinheiten auf dieselbe Weise wie die erste durch. Überführen Sie die Tiere mit einem feuchten Pinsel und setzen Sie sie insgesamt dreimal jeder Kombination aus Reizen und Belohnungen aus.

Platzieren Sie für den experimentellen Test frische Duftbehälter, jeweils einen von jedem Stimulus, an gegenüberliegenden Seiten einer unbeschichteten Agarose-Petri-Schale. Überführen Sie die trainierten Tiere in die Mitte der Schale. Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten.

Nach fünf Minuten eine Schablone unter der Schale verwenden, die deutlich drei Zonen – links, rechts und eine Mitte – definiert, und die Anzahl der Larven in jeder Zone zählen. Die mittlere Zone gilt als Indikator für fehlende Präferenz und macht die Analyse strenger und weniger anfällig für Verzerrungen. Zum Abschluss des Experiments 30 neue, im dritten Larvenstadium befindliche Tiere auswählen und das Training sowie die Prüfung mit der umgekehrten Kombination aus Belohnung und Reizen wiederholen.

Verwenden Sie weiterhin die gleichen Duftbehälter. Es sind mehrere Kontrolltests erforderlich, um zu bestimmen, ob transgene Tiere eine normale Geruchswahrnehmung für die Belohnungsreize aufweisen. Der Test zur naiven Geruchspräferenz beginnt mit dem Sammeln und Waschen von 30 Larven, wie bereits für Training und Test durchgeführt.

Als Nächstes pipettieren Sie die Larven auf eine Agarose-Petri-Schale, auf deren einer Seite sich nur ein Stimulusgefäß befindet. Schließen Sie den Deckel und warten Sie fünf Minuten. Zählen Sie anschließend mithilfe der Vorlage die Anzahl der Larven auf der dem Stimulus zugewandten Seite, in der Mitte und auf der dem Stimulus abgewandten Seite der Schale.

Führen Sie diesen Test für jeden im Experiment verwendeten Reiz durch, um die naive Zuckervorliebe zu überprüfen. Bereiten Sie halbe Petrischalen vor, indem Sie die Hälfte des Agars einer Petrischale ausschneiden und den freien Raum mit geschmolzenem Agar des anderen Typs auffüllen. Achten Sie darauf, dass beide Hälften im Volumen übereinstimmen und keine definierte Kante bilden.

Dies erfordert möglicherweise etwas Übung mit der halben Petrischale, die vorbereitet und auf Raumtemperatur gebracht wurde und auf der 30 naive, gereinigte Futterorganismen platziert sind. Drittens Larven im Sterndesign in die Mitte der Schale geben. Den Deckel schließen und fünf Minuten warten.

Anschließend mithilfe der Vorlage die Anzahl der Larven auf jeder Seite zählen und jene in der Mitte erfassen. Das beschriebene Verfahren wurde verwendet, um trenchgenische Lava zu trainieren und zu testen. Anhand der Beispielreize wurden die Daten als Anzahl der Larven in verschiedenen Bereichen der Petrischalen erfasst.

Nach fünf Minuten außerhalb dieser Datenvorliebe wurden Indizes berechnet und Leistungsindizes aus den gegenseitig trainierten Gruppen abgeleitet. Da die getesteten Larven transgen waren, wurde zusätzlich eine Wahl zwischen einem gefüllten Duftbehälter und Luft sowie eine Wahl zwischen reinen Aros und Aros plus Zucker angeboten. Eine Untersuchung der berechneten Indizes in einem Boxplot zeigte, dass die Tiere lernen konnten, ein Octal von ML-Acetat mithilfe von Fructose-Aros als Appetitverstärker zu unterscheiden.

Die Tiere erkannten beide Reize als Attraktanten und zeigten eine naive Präferenz für Fructose-Aros gegenüber Aero. Dieses experimentelle Paradigma wurde bereits erfolgreich mit einer Vielzahl olfaktorischer und visueller Reize sowie mit unterschiedlichsten belohnenden und bestrafenden Reizen angewandt. In Kombination mit den vielfältigen genetischen Manipulationsmöglichkeiten, die bei Drosophila zur Verfügung stehen, ist dieses Paradigma besonders nützlich zur Aufklärung neuronaler Netzwerke, beispielsweise indem spezifische Neuronengruppen genetisch verändert werden, die durch Gal4-Expressionsmuster definiert sind, um so die funktionelle Rolle dieser Neuronen beim Appetitlernen zu untersuchen.

Mithilfe dieses Verfahrens in Kombination mit genetischer Störung der neuronalen Funktion kann die Analyse der neuronalen Netzwerke im Larvengehirn, die an Lernen und Gedächtnis beteiligt sind, bis auf Ebene einzelner Zellen durchgeführt werden.