Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane dentale Pulpa-Stammzellen aus bleibenden Zähnen mittels zweier Methoden zu isolieren, zu charakterisieren und zu differenzieren. Dies wird erreicht, indem gesunde, retinierte Weisheitszähne gesammelt und zu Beginn im Bereich der Zement-Email-Grenze durchtrennt werden. Dentale Pulpa-Stammzellen (DPSZ) werden durch zwei unterschiedliche Methoden isoliert.

Bei der ersten Methode werden Polypengewebe enzymatisch durch Inkubation in Kollagenase Typ eins zusammen mit Disc-Raum-Lösung verdaut. Wir bezeichnen sie hier als ed. Bezüglich der Isolationsmethode bei der zweiten Methode werden Palp-Gewebe lediglich in den Kolben gegeben, ohne jegliche Verdauung.

Auf diese Weise beginnen dpss, aus dem Gewebe in die Flasche zu migrieren. Diese Zellen, bezeichnet als OG, beziehen sich auf die Auswuchsisolationsmethode. Der zweite Schritt des Verfahrens ist die Identifizierung von Stammzellen mittels Durchflusszytometrie.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Induktion der Odontoblastendifferenzierung, und der letzte Schritt des Verfahrens ist die vergleichende Bewertung der Odontoblastendifferenzierung zwischen zwei Gruppen mittels roter Färbung und QBCR. Ich bin RA Kde von der Abteilung für Stammzellen und Entwicklungsbio­logie am Rian-Institut. Heute werde ich Ihnen die Isolierung, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen unter Verwendung zweier Methoden zeigen.

Hallo, ich bin Dr. Rezaian vom Rio Institute. Wir arbeiten an einem Projekt im Zusammenhang mit humanen dentalen Pulpastammzellen. Diese Zellen sind eine Art mesenchymaler Stammzellen, die leicht mit minimalem Schmerz und geringer Morbidität gewonnen werden können.

Stammzellen zeichnen sich durch ihre Plastizität, die Fähigkeit zur Koloniebildung und ihre multilineage Differenzierungskapazität aus. Hallo, ich bin Dr. Ami aus der Abteilung für Stammzellen. In unserem Institut verwenden wir dieses Verfahren in unserem Labor, um Stammzellen für Forschungsstudien und zukünftige Anwendungen zu isolieren.

In der regenerativen Medizin ist der allererste Schritt für die Nutzung dieser Stammzellquelle für zukünftige, auf Stammzellen basierende Therapien, das beste Protokoll zur Isolierung von Stammzellen aus menschlichem Gewebe zu wählen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es entscheidend, bestimmte Aspekte des zellulären Verhaltens unter verschiedenen Bedingungen der Stammzellisolierung zu untersuchen. Zunächst werde ich humane Stammzellen der Zahnmarkpulpa entweder durch enzymatische Dissoziation der Pulpa oder durch Auswachsen von Stammzellen aus Gewebetransplantaten isolieren.

Dann charakterisieren und differenzieren Sie sie in Ogen-Blasten. Beginnen wir also. Erste Methode: Raum und Kollagenase Typ eins werden beide in PBS gelöst.

Danach filtrieren Sie sie mit einem 0,2-Mikron-Spritzenfilter. Beides in ein kegelförmiges Reagenzglas ziehen. Anschließend Pener und PBS hinzufügen, um die Endkonzentration zu erreichen.

Überführen Sie gesunde Weisheitszähne unter sterilen Bedingungen in das Labor, und zwar in kaltem Basalmedium. Reinigen Sie die Oberfläche des Zahns vor der Untersuchung mit 70 %igem Ethanol. Achten Sie darauf, die Oberfläche des Zahns von Luftzug zu befreien.

Schneiden Sie den Zahn entlang der Zement-Email-Grenze mit einer sterilisierten zahnärztlichen Scheibe an, um die Pulpa zu exponieren. Dabei ist zu beachten, dass der Schneidvorgang langsam erfolgen muss, um eine Überhitzung des Zahngewebes zu vermeiden. Trennen Sie anschließend vorsichtig das Pulpagewebe vom Kronenteil, indem Sie das Pulpagewebe mit der Scarpa-Klinge in Stücke von ein bis zwei Millimeter Länge zerteilen.

Überführen Sie kleine Stücke des Pulpagewebes für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in eine Milliliter Enzymlösung und wirbeln Sie alle 30 Minuten, um die Zerlegung des Pulpagewebes zu unterstützen. Danach entfernen Sie große Aggregate, indem Sie die Suspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb geben. Anschließend fügen Sie PBS mit PENER hinzu und zentrifugieren bei 1.200 U/min für fünf Minuten.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Anschließend suspendieren wir die Platte im Proliferationsmedium pm, überführen sie in den Kulturkolben und fügen Medium hinzu. Danach inkubieren inkubiert.

Ändern Sie das Medium alle drei Tage, bis die Zellkonfluenz für die Outwork-Methode erreicht ist. Wiederholen Sie den Schneidvorgang. Nach dem Schneiden bedeutet „tooth“, das Gewebe in Fragmente von ein bis zwei Millimetern zu zerkleinern.

Danach in die Kultur geben. Mit Proliferationsmedium auffüllen und inkubieren. Es sollte beachtet werden, dass das Gesamtvolumen des Proliferationsmediums ausreichen muss, um die Anheftung aller Gewebestücke für ein weiteres Zellauswachsen zu unterstützen.

Wechseln Sie das Medium nach Beobachtung des Auswachsens und anschließend alle drei Tage, bis die Zellkonfluenz erreicht ist. Für die Immunphänotypisierung inkubieren Sie beide Arten von D-PSCs mit PE- oder FITC-konjugierten Antikörpern 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Anschließend fügen Sie PBS hinzu und zentrifugieren bei 1.200 U/min fünf Minuten lang.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen, suspendieren Sie die Platte in PBS und bewerten Sie abschließend die Oberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Unterziehen Sie beide Arten von DPCs drei Passagen lang einer Subkultur. Dann setzen Sie sie mit Trypsin auf Eis und überführen Sie sie in sechs rote Kulturschalen bei 60 % Konfluenz. Ersetzen Sie das PM durch odontogenes Medium. Drei Vertiefungen verbleiben als Negativkontrolle, indem Sie PM hinzufügen.

Wechseln Sie das Medium alle drei Tage. Am 21. Tag waschen Sie die Zellen mit PBS. Anschließend fixieren Sie sie mit einem Milliliter pro Vertiefung mit 10 % Formalgel für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Nach 15 Minuten das Fixierungsmittel vorsichtig entfernen und die Zellen dreimal mit destilliertem Wasser überspülen. Anschließend das Wasser durch je ein Milliliter pro roter Alza in Rotanfärbungslösung ersetzen. Nach 20 Minuten überschüssigen Farbstoff entfernen und die Zellen viermal mit entionisiertem Wasser waschen.

Danach je Brunnen ein Milliliter Wasser hinzufügen, um zu verhindern, dass die Zellen austrocknen. Nach der Färbung können Sie unter dem Mikroskop im Vergleich zu den Kontrollen sehen, wie drei obere Schienen rot gefärbt werden; bei starker Vergrößerung ist die Aufnahme der Färbung um die Zelle herum sichtbar, was für die Quantifizierung der roten Färbung genutzt werden kann. Nach dem Entfernen des Wassers je Brunnen ein Milliliter 10 % Essigsäure hinzufügen und anschließend 30 Minuten unter Schütteln inkubieren.

Anschließend die Zellen vorsichtig mit einem Zellabstreifer von der Platte abkratzen. Danach in separate Röhrchen überführen. VOR kräftig für 30 Sekunden schütteln.

Erhitzen Sie sie dann auf 85 Grad Celsius für 10 Minuten. Um Verdunstung zu vermeiden, verschließen Sie die Röhrchen mit ParaView und kühlen Sie sie fünf Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie sie anschließend bei 20.000 G für 15 Minuten. In der Zwischenzeit stellen Sie eine serielle Verdünnung des Alizarinrot-Standards gemäß dem Regionsprotokoll her.

Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand und überführen ihn in neue Röhrchen. Puffern Sie den pH-Wert mit 10 % Ammoniumhydroxid. Geben Sie anschließend die Standards und die Proben in die 96er-Platte.

Geben Sie die Zellen in eine Mehrbrunnenplatte und messen Sie anschließend die Absorption bei 405 Nanometer und analysieren Sie die Daten gemäß der Standard-Serienverdünnung. Hier sehen Sie DPCs, die am 10., 15. und 18. Tag durch enzymatische Dissoziation isoliert wurden, sowie ausgewachsene DPCs am 5., 10., 13. und 18. Tag. Beide Arten von DPCs in Probe drei weisen nahezu die gleiche Größe und Morphologie auf. Die Immunphänotypisierung zeigt das Vorhandensein von Markern für mesenchymale Stammzellen wie CD 44, CD 73 und CD 19 sowie das Fehlen hämatopoetischer und endothelialer Marker wie CD 34, CD 45 und CD 11 B. Interessanterweise sind die Expressionen von CD 105 und CD 146 bei den ausgewachsenen DPCs stärker ausgeprägt im Vergleich zu enzymatisch dissoziierten DPCs. Die Quantifizierung der Enzymrot-Färbung am 21. Tag der Odontoblastendifferenzierung zeigt eine stärkere Kalziumablagerung in enzymatisch dissoziierten DPCs im Vergleich zu nicht enzymatisch behandelten dentalen Stammzellen.

Die QPCR-Ergebnisse zeigen ebenfalls eine signifikant höhere Expression von MEP und A LP als Mineralisierungsmarkern in D-P-S-C-D im Vergleich zu den ausgangszahnärztlichen Stammzellen. Gleichzeitig werden beide Gene während der Differenzierung reguliert, und die Expression von DSPP als odontogenem Marker nimmt während der Differenzierung zu. Es gibt jedoch keine signifikante Variation in der Expression von DSVP in differenzierten Zellen zwischen den ED- und OG-Gruppen.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man humane dentale Stammzellen durch enzymatische Dissoziation des Pulpa-Gewebes oder durch Auswachsen von Stammzellen aus Gewebsexplantaten isoliert. Das war's. Ich wünsche Ihnen viel Erfolg beim Anwenden dieses Verfahrens in Ihrem Experiment.

Vielen Dank.