Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Interaktionspartner von Grab zwei mittels CDNA-Expressionsklonierung und Beobachtung von Veränderungen des mit grün fluoreszierendem Protein markierten Grab zwei zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst als erster Schritt eine CDNA-Bibliothek aus bakteriellen Lysaten hergestellt wird. Im zweiten Schritt werden die CDNAs in humane embryonale Nierenzellen transfiziert, was zur Expression des Reporterkonstrukts zusammen mit den Genen von Interesse führt.

Anschließend werden die transfizierten Platten am Opera-Mikroskop analysiert, um Veränderungen in der Lokalisation von Grab2 in den Zellen sichtbar zu machen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-vermittelte Rekrutierung von GFP-markiertem Grab2 zu Endosomen basierend auf der Fluoreszenzmikroskopie. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie dem Hefe-Zwei-Hybrid-System besteht darin, dass Interaktionspartner von Grab2 unter physiologischen Bedingungen identifiziert werden können, wobei die subzelluläre Verteilung der Interaktionspartner berücksichtigt wird.

Auch wenn diese Methode verwendet werden kann, um die Signaltransduktion durch Grab zwei nachzuweisen, ist sie ebenfalls auf andere Systeme übertragbar, beispielsweise auf andere Proteine von Interesse. Die cDNA-Bibliothek liegt in Form einzelner baktenieller Klone in Glycerinstöcken vor.

In einem 96-Well-Format unter Verwendung des Re-Ray-Befehls im Picker-Menü des Hudson Rapid Pick Light werden bakterielle Klone von der Quellplatte aufgenommen und in 1,5 Milliliter LB-Amp in einer 96er-Tiefbrunnenplatte angeimpft. Die Tiefbrunnenplatten werden anschließend mit einer gasdurchlässigen Folie verschlossen und über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Schüttler inkubiert. Am folgenden Tag werden die Tiefbrunnenplatten, die die Bakterien enthalten, bei 2000 U/min 20 Minuten lang zentrifugiert.

Unter Verwendung von Plattenadaptern in einer Tischzentrifuge das Medium von den Vertiefungen abziehen, wobei das bakterielle Pellet intakt bleibt. Als Nächstes die Arbeitsfläche der Tecan-Freedom-Evo-Automatisierungsplattform wie hier gezeigt konfigurieren. Lösungen für die Plasmidpräparation in Rinnen eins bis fünf verteilen und eine Tieflochplatte auf die Arbeitsfläche stellen.

Stellen Sie einen Mehrfachbrunnen mit Alucian-Lösung neben die Tiefbrunnenplatte. Laden Sie die Spitzen in die Spitzenracks. Bauen Sie das Vakuummanifold zusammen. Die Plasmid-Bindungsplatte wird in das Manifold eingesetzt und die Plasmid-Filterplatte auf das Manifold gelegt. Resuspendieren Sie die Pellets mit 250 Mikrolitern Lösung eins.

Den Resus-Aufschwemmungspuffer durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Es ist entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens, sicherzustellen, dass die Pellets vollständig resuspendiert sind. Ein Schüttler kann verwendet werden, falls das Auf- und Abpipettieren die Pellets nicht vollständig resuspendiert.

Nachdem die Pellets vollständig resuspendiert sind, fügen Sie 250 Mikroliter der Lösung zum Lysepuffer hinzu, um die Bakterien aufzulysieren. Verschließen Sie die Platte und drehen Sie sie um, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Stellen Sie einen Timer auf zwei Minuten.

Fügen Sie anschließend 350 Mikroliter Lösung drei hinzu, dem Neutralisierungspuffer. Verschließen Sie die Platte und invertieren Sie sie dreimal.

Überführen Sie die bakteriellen Lysate in die Plasmid-Filterplatten. Unterziehen Sie sie fünf Minuten lang einem Vakuum. Entfernen Sie die Filterplatte und setzen Sie die Bindungsplatte auf den Manifold.

Unter Vakuum eine Minute lang abziehen. 500 µL zusätzlichen Waschpuffer hinzufügen und zwei Minuten lang unter Vakuum abziehen. 900 µL Waschpufferlösung vier hinzufügen und zwei Minuten lang unter Vakuum abziehen.

Danach erneut 900 Mikroliter Waschpufferlösung hinzufügen und 15 Minuten unter Vakuum setzen. Die DNA-Sammelplatte in das Manifold geben. 100 Mikroliter Eluierpuffer zur Bindungsplatte hinzufügen und zwei Minuten lang inkubieren.

Wenden Sie 10 Minuten lang Vakuum an. Entfernen Sie abschließend die Sammelplatte und messen Sie die DNA-Konzentration mit dem NanoDrop 8,000. Typischerweise kann mit dieser Methode eine Ausbeute von etwa 100 Nanogramm pro Mikroliter erzielt werden, um dieses Verfahren zu beginnen.

Nachdem die HEK 293-Zellen trypsinisiert und gezählt wurden, geben Sie mithilfe eines automatischen Dosiergeräts jeweils zwei mal 10 hoch vier Zellen in jede Vertiefung einer Perkin Elmer View-Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zur Transfektion.

Verwenden Sie den automatisierten Flüssigkeitshandler, um in jedem Brunnen einer runden 96-Well-Platte folgende Mischung herzustellen: 100 Nanogramm GFP. Geben Sie zwei Plasmid-DNA mit jeweils 100 Nanogramm CD-NA in 25 Mikroliter serumfreiem Medium hinzu. Fügen Sie anschließend 25 Mikroliter serumfreies Medium hinzu, das 0,5 Mikroliter Transfectin pro Brunnen enthält, und starten Sie die Zeitschaltung für 30 Minuten.

Nach 30 Minuten 50 Mikroliter der cDNA-Transfektionsmischung in die Zellen überführen. Verwenden Sie dazu eine schonende Dosiermethode. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um die Bildaufnahme zu beginnen, starten Sie die Opera-Software. Wählen Sie den Konfigurationsreiter und anschließend das 20-fache Objektiv sowie den korrekten Plattentyp aus. Stellen Sie sicher, dass die Kollektoreinstellung am Objektiv auf den richtigen Wert für den jeweiligen Plättentyp eingestellt ist, um eine Fokussierung mit verschiedenen Plättentypen zu ermöglichen.

Wählen Sie als Nächstes die Mikroskop-Registerkarte aus. Definieren Sie die erste Belichtung als Fite 4 88 Laser und die zweite Belichtung als UV 365 Laser. Aktivieren Sie den UV-Filter bei beiden Belichtungen und weisen Sie die Belichtung zu.

Eins an Kamera eins und Belichtung. Zwei an Kamera zwei. Stellen Sie die Belichtungszeiten auf 800 Millisekunden für die Belichtung eins und auf 40 Millisekunden für die Belichtung ein.

Zwei, Belichtung auswählen, Fokushöhe auf null Mikrometer einstellen. Fokussieren, sobald fokussiert ist. Kamera eins belichten.

Stellen Sie die Fokus­höhe ein, um die Belichtungsebene zu optimieren, und klicken Sie auf „Höhe aufnehmen“. Speichern Sie die Belichtungs­parameter und wiederholen Sie den Vorgang für die Belichtung. Zwei: Wählen Sie den Reiter „Experiment­definition“, erstellen Sie ein Layout und ein Unterlayout.

Ziehen und legen Sie das entsprechende Layout, die Belichtung, das Referenzbild, die Schräglage, die Beschneidungsdatei und das Teil-Layout ab. Speichern Sie das Experiment. Wählen Sie die Registerkarte für automatische Experimente und nehmen Sie Bilder unter normalen Bedingungen auf.

Grab zwei ist in der gesamten Zelle lokalisiert. Nach Stimulation eines Wachstumsfaktor-Rezeptors transloziert es an die Plasmamembran und wird anschließend in Endosomen internalisiert. In dieser Abbildung zeigt das obere Feld CO M sechs Zellen, die vorübergehend mit GFP-Grab zwei transfiziert wurden, und wie erwartet ist die Fluoreszenz in der gesamten Zelle verteilt.

Jedoch verlagert sich bei Zellen, die vorübergehend mit GFP-Grab2 und dem Zelloberflächenrezeptor EGFR transfiziert wurden, Grab2 in endosomenähnliche Strukturen, wie in der unteren Abbildung dargestellt. Daher kann bei Anwendung einer genomweiten Bibliothek erwartet werden, dass neuartige Grab2-bindende Zelloberflächenproteine identifiziert werden können. Diese Methode beschränkt sich nicht auf den Nachweis von Zelloberflächenproteinen.

Zum Beispiel induziert das GPA-Protein DYNAMIN zwei, das an der grab zwei-vermittelten Endozytose beteiligt ist, eine Translokation von grab zwei. In diesem Experiment wurde GFP-grab zwei gemeinsam mit DNM zwei in HEC 293T-Zellen transfiziert. Die Umlokalisierung von GFP-grab zwei zu endosomenähnlichen Strukturen wird durch die Zellen innerhalb der roten Kreise veranschaulicht.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie die Immunpräzipitation oder biochemische Assays verwendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die Interaktion direkt oder indirekt ist. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mittels Expressionsklonierung subzelluläre Proteininteraktionen identifizieren kann.