Optical Trapping von Nanopartikeln

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Apertur-Optikfallenanordnung zu erstellen, um Partikel mit einer Größe von etwa 20 Nanometern einzufangen. Dazu wird einem bestehenden optischen Laserfallensystem ein Detektor hinzugefügt, um Messungen zu ermöglichen. Anschließend wird die zu messende Nanopartikellösung in eine mikrofluidische Kammer mit der Doppelnanolochfalle abgegeben, und die Kammer wird in die optische Fallenanordnung eingesetzt.

Wenn ein Teilchen in die beleuchtete Öffnung eintritt, erhöht sich die Lichttransmission stark aufgrund der dielektrischen Belastung. Versucht das Teilchen, die Öffnung zu verlassen, bewirkt die verringerte Transmission eine Impulsänderung nach außen, weg von der Öffnung, was gemäß dem dritten Newtonschen Gesetz eine Kraft erzeugt, die das Teilchen zurück in die Öffnung zieht und es so festhält. Das Teilchen verursacht eine Rotverschiebung der Transmissionkurve, die überwacht werden kann.

Daher kann die Falle zu einem Sensor werden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Fangereignisse von Nanopartikeln zeigen, einschließlich des Entfaltens eingefangener Proteine, wie durch Änderungen der Laserintensität durch das doppelte Nanoloch angezeigt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der optischen Fallenstellung mittels Gradientenkraft besteht darin, dass sie kleinere Nanopartikel mit niedrigeren Laserintensitäten einfangen kann.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Biochemie zu beantworten, wie beispielsweise, wie einzelne Proteine falten und miteinander wechselwirken, und wie Viruspartikel lebende Zellen infizieren. Im Allgemeinen haben Personen bei dieser Methode Schwierigkeiten, da es schwer ist, das doppelte Nanoloch in ein bestehendes Lasermesssystem zu integrieren. Der optische Fallen-Aufbau basiert auf einem optischen Pinzettenset von Thor Lab, das mit einem Kraftmessmodul ausgestattet ist.

Ein Avalanche-Photodiod wird verwendet, um den Quadrantendetektor im Kraftmessmodul zu ersetzen. Beim Aufbau des optischen Fangsystems sollte immer dann, wenn der Laser eingeschaltet ist, Augenschutz getragen werden. Stellen Sie sicher, dass der Strahl innerhalb eines sicheren Bereichs verbleibt, indem das System in einem geschlossenen Raum betrieben wird und der Strahl so weit wie möglich innerhalb der Fanganordnung begrenzt wird; reflektierender Schmuck sollte vermieden werden.

Es werden Latexhandschuhe getragen. Um die Sauberkeit der Optik zu gewährleisten, richten Sie den optischen Pinzettensatz und das Kraftmessmodul ein. Gemäß den Herstelleranweisungen verfügt der montierte optische Pinzettensatz über eine umgekehrte Lichtmikroskop-Design und besteht aus folgenden Komponenten: einem Fanglaser, einem 100x-Ölimmersionsobjektiv, einer dreidimensionalen Probentischpositionierung und einer CCD-Kamera.

Bitte beachten Sie, dass beim Umgang mit Laserdioden ein Schutz vor elektrostatischer Entladung empfehlenswert ist. Das Kraftmessmodul ermöglicht die Kalibrierung der optischen Pinzetten mittels positionsbasierter Detektion der hinteren Brennebene des Kondensors. Eine silikonbasierte Lawinen-Fotodiode oder eine Fotodiode wird anstelle der Kraftmessmodule verwendet.

Der Quadrant-Positionsdetektor fügt außerdem einen Widerstands-Kondensator- oder RC-Filter mit einem 200-Kiloohm-Widerstand und einem 100-Pikofarad-Kondensator ein. Dieser dient zur Reduzierung von hochfrequentem Rauschen und erleichtert die Beobachtung von Fangereignissen auf dem Oszilloskop. Verwenden Sie ein Koaxialkabel, um den RC-Filter nach dem A PD anzuschließen. Anschließend schließen Sie mithilfe von Koaxialkabeln und einem T-Adapter das Oszilloskop und das Datenerfassungsmodul an den RC-Filter an.

Das System ist nun bereit für die Probenaufgabe. Die Doppelnanolochblende besteht aus zwei Nanolöchern, die mittels eines fokussierten Ionenstrahls in einen Goldfilm gebohrt wurden. Der Film ist 100 Nanometer dick und wird von einem Glas-Substrat getragen.

Die Nanolöcher überlappen sich und erzeugen zwei scharfe Spitzen. Nanopartikel werden durch Laserlicht, das auf das Doppelnanoloch trifft, im Spalt zwischen diesen Spitzen eingefangen.

Große Registrationsmerkmale sollten ebenfalls in den Metallfilm eingebracht werden, um die Identifizierung der Doppel-Nanoloch-Position im optischen Mikroskop zu erleichtern. Diese Merkmale sollten etwa 100 Mikrometer vom Doppel-Nanoloch entfernt angeordnet sein. Geben Sie 10 Gramm Polydimethylsiloxan oder PDMS-Basis und ein Gramm Härter in einen Einwegbecher und mischen Sie einige Minuten lang.

Anschließend wird das Gemisch in einer Vakuumkammer entgast, bis alle Blasen verschwunden sind. Danach gießen Sie 1,5 Gramm PDMS in eine Petrischale mit einem Durchmesser von neun Zentimetern. Beschichten Sie den Boden der Petrischale durch Aufdampfen des PDMS bei 950 U/min für 65 Sekunden gemäß dem Schleuderverfahren.

Die Dicke ist nicht kritisch, solange sie unter 80 Mikrometern liegt. Platziere vorsichtig drei bis fünf Deckgläser der Größe 1,5 auf dem PDMS, sodass sie sich nicht überlappen, und evakuiere sie 30 Minuten lang.

Falls sich die Deckgläser während der Evakuierung bewegt und übereinander gestapelt haben, vorsichtig auseinanderschieben. Dabei darauf achten, dass die PDMS-Schicht unter den Deckgläsern dünn und gleichmäßig bleibt. Anschließend die Petrischale erneut 30 Minuten lang evakuieren.

Entfernen Sie die Petrischale aus der Vakuumkammer und erhitzen Sie sie 20 Minuten lang auf einem Heizblock bei 85 Grad Celsius, um das PDMS zu aushärten. Sobald das PDMS erstarrt ist, schneiden Sie mit einer Rasierklinge entlang der Ränder einer der Deckgläser. Heben Sie dann vorsichtig mit einer feinen Pinzette oder einer Klinge das Deckglas an. Eine dünne PDMS-Schicht bleibt am Deckglas haften.

Legen Sie das Deckglas mit PDMS in eine neue Petrischale. Schneiden Sie dann mit einer Rasierklinge ein drei Millimeter mal drei Millimeter großes Fenster in das PDMS aus. Dieses Fenster bildet die Kammer, in der die Nanopartikellösung aufbewahrt wird.

Verwenden Sie einen Laserschneider, um einen Acryl-Objektträgerhalter mit einem Loch von drei Viertel Zoll Durchmesser in der Mitte herzustellen. Kleben Sie den Umfang des Lochs mit doppelseitigem Klebeband ab. Schneiden Sie mithilfe eines Rasierklinge jegliches überschüssige Klebeband ab.

Platzieren Sie den hergestellten Objektträger auf einer der vorbereiteten mit PDMS beschichteten Deckgläsern, sodass das PDMS zwischen Glas und Acryl eingeschlossen ist. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette einige Tropfen einer 0,05 %igen (Gewicht pro Volumen) Polystyrol-Nanosphären-Lösung auf das PDMS-Fenster.

Ein Tropfen auf den Goldfilm an der Stelle, an der sich die Nanolöcher befinden, hinzufügen. Die Goldprobe so auf Deckgläsern platzieren, dass die Nanolöcher innerhalb des PDMS-Fensters liegen. Sicherstellen, dass keine Blasen in der Kammer vorhanden sind.

Drücken Sie dann die Goldprobe vorsichtig auf die Deckplatte. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit durch Vorsichtiges Abtupfen, da ein Öl-Immersion-Objektiv verwendet wird. Geben Sie einen Tropfen Öl auf die gegenüberliegende Seite der Deckplatte, direkt auf das PDMS-Fenster.

Beachten Sie die Position der Nanolöcher. Setzen Sie das Mikroskop ein. Führen Sie den Objektträger mit der Öltropfen-Seite nach unten in den Objektträgerhalter ein und senken Sie anschließend den Halter so weit ab, bis das Immersionsöl mit dem Mikroskop in Kontakt kommt.

Objektiv, justieren Sie grob den Objekttisch so, dass sich die in den Goldfilm eingebrannten Registrierungsmarken unterhalb des Objektivs befinden. Verwenden Sie eine Bildaufnahmesoftware wie Thor site, die als Teil des Fang-Kit enthalten ist. Suchen Sie die Registrierungsmarken auf dem Goldfilm und folgen Sie den Hinweislinien zu den Nanolöchern.

Platzieren Sie den Objektträger so, dass die Kennmarkierungen und andere freie Bereiche vom Bildschirmzentrum freigegeben sind. Eine übermäßige Lichtdurchlässigkeit kann die A PD beschädigen und die Laseraktivierung verhindern. Da der dichroische Spiegel nicht perfekt ist, sollte ein Punkt nahe dem Zentrum des Bildschirms durch den Laserstrahl sichtbar werden.

Verwenden Sie die Software zur Steuerung des Piezostages, um die Ausrichtung entlang aller drei Achsen weiter zu optimieren. Bei korrekter Ausrichtung wird eine maximale Photodiodenspannung beobachtet, was auf die höchste Transmission durch die Nanoöffnung hinweist.

Nun, da das System eingerichtet ist und die Probe geladen wurde, können optische Fangdaten aufgezeichnet werden. Mithilfe der Markierungshinweise positionieren Sie den Fleck nahe einer bekannten Nanolochposition. Die doppelten Nanolöcher sind zu klein, um klar aufgelöst zu werden, und erscheinen auf dem Bildschirm als kleine Punkte.

Die Lichtdurchlässigkeit durch die Probe wird durch den Signalpegel auf dem Oszilloskop angezeigt. Richten Sie die Probe weiter aus, um die Lichtdurchlässigkeit zu maximieren. Achten Sie auf Markierungen sowie sichtbare und unsichtbare Kratzer, da die Lichtdurchlässigkeit in diesen Bereichen hoch sein wird; Nanolöcher zeigen plötzliche Sprünge in der Lichtdurchlässigkeit, während Kratzer dies nicht tun.

Zeigen Sie mithilfe der Wellenplatte allmählichere Änderungen an. Stellen Sie die Lichtpolarisation so ein, dass die höchste Lichtdurchlässigkeit erreicht wird, da die doppelte Nano-Loch-Struktur polarisiert ist. Um Daten zu erfassen, nehmen Sie die Spannung der APDs über das Datenerfassungsmodul für die gewünschte Zeitdauer auf.

Die Aufnahmezeiten liegen typischerweise im Bereich mehrerer hundert Sekunden. In diesem Fall wird eine benutzerdefinierte Software für die Datenaufnahme verwendet, und die Spannung wird 2000-mal pro Sekunde abgetastet. Filtern Sie die aufgezeichneten Daten mithilfe von MATLAB mit einem KY-Gole-Filter und stellen Sie sie in einem Diagramm in Abhängigkeit von der Zeit dar, um das Einfangen von 20 Nanometer großen Polystyrol-Nanopartikeln zu zeigen; dabei wurde die Transmission durch das doppelte Nanoloch als Funktion der Zeit gemessen.

Mithilfe der a PD wurde anschließend die optische Transmission aufgetragen. Im Zeitverlauf ist das Einsperrereignis charakteristischerweise plötzlich und weist eine scharfe Kante auf, die einen deutlichen Übergang zwischen zwei Transmissionsleistungsniveaus zeigt, wie in diesem Beispiel dargestellt. Im eingesperrten Zustand tritt häufig eine Zunahme der Signalerhöhung auf. Diese Zunahme des Rauschens resultiert aus der brownschen Bewegung des eingefangenen Teilchens.

Beachten Sie, dass diese Rauschquelle ohne das eingefangene Teilchen nicht vorhanden ist. Es können Artefakte in den Ergebnissen auftreten, die keine Hinweise auf Fangereignisse darstellen. Ergebnisse, die Driften zeigen – erkennbar als langsame Änderungen der Transmission über einen Zeitraum von mehreren Minuten, wie hier dargestellt –, sollten verworfen werden. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Ramanspektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Natur des eingefangenen Nanopartikels nach seiner Entwicklung zu beantworten.

Diese Technik hat es Forschern ermöglicht, biologisch relevante Nanopartikel auf Ebene des einzelnen Moleküls zu untersuchen. Zum Beispiel, um die Proteinbindung und die Virusinfektion jeweils auf Ebene des einzelnen Moleküls nachzuweisen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine doppelte nho-Optische-Falle in ein Inverter-Mikroskop-Laser-T-System integriert, um einzelne Nanopartikel einzufangen.