Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den Effekt einer ACF one- oder SNF two H-Genabschaltung auf die durch E four or four induzierte Zelltod zu beobachten. Dies wird erreicht, indem Zelllinien erzeugt werden, in denen die Expression von ACF one- oder SNF two H-sRNA durch Zugabe von Doxycyclin bedingt aktiviert wird, was zu verringerten Konzentrationen des ACF one- oder SNF two H-Proteins führt. In einem zweiten Schritt werden Zellen der erhaltenen Zelllinien entweder mit Doxycyclin behandelt, um die Expression von ACF one oder SNF two H zu reduzieren, oder sie bleiben unbehandelt.

Als Nächstes wird E vier oder vier in Zellen mit oder ohne S-H-R-N-A-resistentes ACF eins oder SNF zwei H exprimiert. Um den Einfluss von ACF eins oder SNF zwei H auf den durch E vier oder vier induzierten Zelltod zu untersuchen, werden Ergebnisse erhalten, die den Effekt der ACF-eins- oder SNF-zwei-H-Konzentrationen auf die Toxizität von E vier oder vier zeigen, basierend auf der Zählung von Kernen mit apoptotischer Morphologie mittels des JY-Assays. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie der transienten Transfektion von RNAs besteht darin, dass alle Zellen die S-H-R-N-A exprimieren und der Prozentsatz an Zellen, die gleichzeitig mit herkömmlichem Plasmid koexprimieren, höher ist. Diese Methode liefert Einblicke in die Mechanismen, die dem durch if 4 0 4 induzierten Zelltod zugrunde liegen, kann aber auch zur Untersuchung anderer protischer Proteine angewendet werden.

Zusätzlich zu Ana Lafe wird ein weiterer Forscher aus meinem Labor Teile dieses Verfahrens demonstrieren. Um mit der Erzeugung induzierbarer Zelllinien zu beginnen, säen Sie T-Rex-293-Zellen mit einer Dichte von etwa 5 × 10⁶ Zellen pro 10-Zentimeter-Platte in acht Milliliter DMEM, das Serum enthält, jedoch kein Tetracyclin, sowie fünf Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin, aus. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Am folgenden Tag ersetzen Sie das Medium durch acht Milliliter frisches Medium vor der Transfektion. Das für die Transfektion verwendete Plasmid ist das pSuperior-neo-plus-GFP-Plasmid, das ACF1 oder SNF2H-S-H-R-N-A unter Kontrolle eines tetracyclininduzierbaren H1-Promotors kodiert, sowie das Neomycinresistenzgen, das mit GFP fusioniert ist und unter Kontrolle eines konstitutiven PGK-Promotors steht.

Fügen Sie 10 Mikrogramm Plasmid-DNA zu 500 Mikrolitern 150 Millimolar Natriumchlorid hinzu und wirbeln Sie gründlich. Geben Sie dann das jet PY-Reagenz in einer Menge von zwei Mikrolitern pro Mikrogramm DNA zu einem anderen Gefäß mit 500 Mikrolitern 150 Millimolar Natriumchlorid und wirbeln Sie erneut gründlich. Fügen Sie die jet pie-Lösung zur DNA hinzu und mischen Sie gut durch Wirbeln.

Ansatz bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren. Nach 15 Minuten die DNA-Komplexe vorsichtig auf die 10 cm-Platten mit 70 bis 80 % Konfluenz pipettieren. T-Rex 2 9 3-Zellen am folgenden Tag mischen.

Ersetzen Sie das Medium durch ein selektives Medium, in diesem Beispiel DMEM wie zuvor, das 500 Mikrogramm pro Milliliter G418 enthält. Überwachen Sie die Zellen während der nächsten zwei Wochen. Ersetzen Sie das selektive Medium alle drei bis vier Tage durch ein frisches, ähnliches Medium, bis Kolonien erscheinen.

Identifizieren Sie die Kolonien visuell und markieren Sie ihre Position auf der Unterseite der Platte mit einem farbigen Stift. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Kolonien gut getrennt sind. Die Kolonien können isoliert werden, sobald sie groß genug sind, um ohne Mikroskop sichtbar zu sein.

Für den Erfolg dieses Verfahrens ist es wichtig, bei der Kolonieisolierung gut getrennte Kolonien auszuwählen. In einer sterilen Haube das Medium von der Platte abpipettieren. Vorsichtig mit PBS spülen und restliche Flüssigkeit vollständig abpipettieren.

Gebe drei Mikroliter 0,25 % Trips in EDTA auf eine Kolonie auf der Platte, indem du die Trips wiederholt aufpipettierst, bis die Zellen sich von der Platte lösen. Überführe die Zellen in selektives Medium in einem Mulden einer 24-Mulden-Platte. Wiederhole dies für mehrere weitere Kolonien auf der Platte.

Züchten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis sie die Vertiefung vollständig besiedelt haben. Anschließend teilen Sie die Zellen jeder ursprünglichen Kolonie auf drei Vertiefungen einer separaten 12-Loch-Platte auf und inkubieren sie über Nacht am folgenden Tag. Ersetzen Sie das Medium in einer Platte durch Medium, das ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin aus einer in doppelt destilliertem Wasser hergestellten Stammlösung enthält.

Ersetzen Sie das Medium in einer Kontrollplatte durch Medium ohne Doxycyclin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 72 Stunden. Anschließend werden Zellen aus einem behandelten und einem unbehandelten Well zur Western-Blot-Analyse geerntet, um die Effizienz der ACF1- oder SNF2h-Genabschaltung zu bestimmen. Ein repräsentatives Ergebnis ist hier dargestellt.

Diese Blot wurde mit Antikörpern gegen SNF zwei H und Alpha-Tubulin gefärbt. Letzteres diente als Ladekontrolle für die beiden Klone. Die Klone Nummer vier und Nummer fünf zeigten eine starke Verringerung von SNF zwei H nach Doxycyclin-Induktion und wurden daher für die Verwendung im Knockdown-Experiment ausgewählt, das im nächsten Abschnitt gezeigt wird.

Die unbehandelten Zellen in der dritten Platte werden verwendet, um die ausgewählte Zelllinie zu vermehren, und Aliquots dieser Zellen werden anschließend eingefroren. Für die weitere Verwendung zur Induktion der Knockdowns von ACF eins oder SNF zwei H-Plattenzellen in selektivem Medium in 10-Zentimeter-Platten, Doxycyclin in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter in die Hälfte der Platten geben und 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid für 48 bis 72 Stunden inkubieren. Jede Gruppe von Platten muss Zellen für 12 Sechs-Zentimeter-Platten liefern, einschließlich zwei Duplikaten für den DPI-Assay für jeden Zeitpunkt sowie je einer Platte für die Western-Blot-Analyse jeder Probe.

48 bis 72 Stunden nach der Induktion die Zellen jeder Gruppe mit Trypsin lösen, anschließend zählen und 1,5 × 10⁶ Zellen pro 6-cm-Platte in dem gleichen Medium mit oder ohne Doxycyclin ansäen. Die Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid inkubieren und am folgenden Tag wie angegeben transfectieren.

Sowohl die unbehandelten als auch die mit Doxycyclin behandelten Zellen werden in vierfacher Weise jeweils im Dreifachansatz transfiziert. Einmal mit einem leeren Plasmid und einem Plasmid, das GFP exprimiert; zweitens mit dem leeren Plasmid sowie einem Vektor, der SHRA-resistentes ACF1-GFP oder SNF2h-GFP exprimiert; drittens mit einem Plasmid, das E4 oder E4-allel4 kodiert, und einem Plasmid, das GFP exprimiert; und viertens mit dem Plasmid, das E4-allel4 kodiert, sowie dem Vektor, der SHRA-resistentes ACF1-GFP oder SNF2h-GFP exprimiert. Nach der Transfektion werden alle Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Am Tag nach der Transfektion der Zellen extrahieren Sie Proteine von einer Platte pro Probe für die Western-Blot-Analyse, um zu überprüfen, ob ACF1 oder SNF2H effizient herunterreguliert wurden und ob E4F1 in den verschiedenen Proben gleichmäßig exprimiert wurde. Die verbleibenden 16 Platten werden für den DPI-Assay verwendet. Entfernen Sie per Aspiration das Medium von den für den DPI-Assay bestimmten Platten und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS in einer chemischen Abzugshaube.

Geben Sie ein Milliliter 4 % Paraformaldehyd, hergestellt in PBS, hinzu, um die Zellen zu bedecken, und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Aspirieren Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie mit PBS unter Schütteln bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal, insgesamt drei Waschungen. Nach der dritten PBS-Waschung in 80 % Ethanol, das bei minus 20 Grad Celsius aufbewahrt wird, inkubieren Sie bei minus 20 Grad Celsius für mindestens eine Stunde.

Entfernen Sie das Ethanol und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, jeweils fünf Minuten lang unter Schütteln bei Raumtemperatur; anschließend waschen Sie einmal fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS, das 0,5 % BSA und 0,05 % Tween 20 oder P-B-S-B-T enthält. Schütteln Sie ebenfalls, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern. Blockieren Sie die Zellen in einem Milliliter P-B-S-B-T-Puffer, der 10 % Zieuserserum enthält, für 20 Minuten unter Schütteln bei Raumtemperatur.

Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal in P-B-S-B-T, jeweils fünf Minuten pro Waschgang. Inkubieren Sie die Zellen mit dem primären Antikörper, in diesem Fall einem E vier oder vier-spezifischen Antikörper, in einem Milliliter P-B-S-B-T eine Stunde lang unter Schütteln bei Raumtemperatur. Anschließend zweimal in P-B-S-B-T und einmal in PBS mit 0,1 % BSA waschen, jeweils fünf Minuten pro Waschgang.

Fügen Sie danach den Zellen ein Milliliter PBS mit 0,1 % BSA hinzu, das den geeigneten sekundären, fluoreszenzmarkierten Antikörper und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter enthält. Die Endkonzentration von DPI inkubieren Sie 40 Minuten lang unter Schütteln bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie abschließend fünf Minuten lang mit PBS.

Trocknen Sie die Vertiefung durch Absaugen und belassen Sie die Platten zusätzlichen eine Stunde bis über Nacht verkehrt herum, um eine vollständige Trocknung zu erreichen. Bedecken Sie die Zellen mit Abdeckplättchen aus Aluminiumfolie unter Verwendung von Flora-Mount-G-Lösung. Bewahren Sie die Platten bei vier Grad Celsius im Dunkeln auf, bis sie zur Zählung bereit sind. Die apoptotischen Zellkerne, die den in dem Protokoll beschriebenen verschiedenen Behandlungen unterzogen wurden, wurden fixiert und mit E-vier-oder-vier-spezifischen Antikörpern sowie DPI gefärbt, um die Kerne transfizierter Zellen sichtbar zu machen.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für Zellen, die E vier oder vier und GFP exprimieren. Panel A zeigt die alleinige Expression des Kontroll-GFP-Proteins, und Panel B zeigt die Expression von E vier oder vier. Die mit DAPI gefärbten Zellkerne sind in Panel C dargestellt, und die überlagerten Bilder sind in Panel D zu sehen. Die weißen Pfeile markieren GFP- und E.vier-oder-vier-transfizierte Zellen mit Kernen, die eine apoptotische Morphologie aufweisen. Rote Pfeile markieren Kerne mit unregelmäßigen Formen, die nicht als apoptotische Kerne gezählt werden. Ein Sternchen markiert mitotische Kerne oder Kerne, die sich gerade geteilt haben. Die Anzahl der kondensierten oder fragmentierten Kerne, die mittels DAPI-Färbung sichtbar gemacht wurden, wurde gezählt, um den Prozentsatz der Kerne mit apoptotischer Morphologie innerhalb der transfizierten Zellpopulation zu berechnen, um eine optimale Objektivität des Tests zu gewährleisten.

Die Zählung apoptotischer Zellkerne in den verschiedenen Proben erfolgte verblindet, wobei die zählende Person die Identität der Proben nicht kannte. Ein repräsentatives Ergebnis ist in diesem Diagramm dargestellt. Höhere Anteile an nukleären Abnormalitäten wurden in E4orf4-exprimierenden Zellen beobachtet, was bestätigt, dass E4orf4 Zelltod induziert. Der höchste Prozentsatz an nukleären Abnormalitäten wurde in E4orf4-exprimierenden Zellen festgestellt, in denen die Mengen von ACF1 durch eine SHRNA-vermittelte Abschaltung reduziert waren, was darauf hinweist, dass die Abschaltung von ACF1 den E4orf4-vermittelten Zelltod verstärkt und die Toxizität von E4orf4 in Zellen erhöht.

Ein geringer Expressionsgrad von ACF resultierte nicht aus einer Erhöhung der E vier oder vier Niveaus, wie im Westernblot zu sehen ist. Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, eine empfohlene Zählung der apoptotischen Nucleoli mit DPI zu ermöglichen und strikte Kriterien für die Identifizierung dieser Nucleoli anzuwenden. Zusätzlich zu diesem Verfahren können andere Methoden wie klonogene Assays durchgeführt werden, um die Ergebnisse des DA pse nach diesem Verfahren zu validieren.

Andere Methoden wie Co-Immunpräzipitationsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel, ob eine physikalische Interaktion zwischen den untersuchten Proteinen besteht.