Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Plattform für die Kultur von neuronalen Axonen und Astroglia, um die Interaktionen zwischen Neuronen und Gliazellen mittels hochauflösender Bildgebung zu analysieren. Zunächst wird die mikrofluidische Kulturkammer zusammengesetzt, neuronale Kulturen werden vorbereitet und die neuronalen Axone werden dazu angeregt, in die gegenüberliegende Seite der MCP einzudringen. Anschließend werden kultivierte Astrozyten hinzugefügt, um ein kompartimentalisiertes Kokultursystem herzustellen. Ergebnisse, einschließlich Zeitrafferaufnahmen mittels konfokaler Immunfluoreszenzmikroskopie, können helfen, die Interaktionen zwischen Axonen, Astroglia und neuronalen Axonen zu verstehen.

Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich aus dem Bestreben, den Einfluss des neuronalen Prozesses von der neuronalen Sekretion auf die Regulation der GT eins zu trennen. In der Regel haben Personen, die neu in der Methode sind, Schwierigkeiten damit, Axone in einen anderen Bereich des zellulären Kompartiments zu induzieren. Dies erfordert eine hohe Dichte gesunder Neuronen, die auf der neuronalen Seite platziert sind, wobei die Neuronen nahe den zentralen Kanälen ausgesät werden müssen.

Die offenen Kammern des MCP sind für kompartimentierte Kulturen verschiedener Zelltypen konzipiert; Beschichtungen mit Polyurethan und Laminin sind notwendig, um Neuronen und Astrozyten in der Co-Kultur anzusiedeln. Tragen Sie zunächst eine Polyurethan-Lösung mit einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter auf sterile Glasbodenschalen auf und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie die beschichteten Glasbodenschalen dreimal mit doppelt destilliertem Wasser und stellen Sie sie anschließend unter einem sterilen Abzug zum Trocknen ab.

Als Nächstes beschichten Sie die Schale mit einem Milligramm pro Milliliter Laminin und trocknen sie eine Stunde unter UV-Licht. Die Montage des MCP in der Schale mit Glasboden sollte vor der Verwendung frisch hergestellt werden. Positionieren Sie die mikrofluidische Kulturplattform mit den zentralen Verbindungskanälen an ihrer Unterseite und bilden Sie eine dichte Verbindung mit dem beschichteten Glas.

Untere Schalen. Geben Sie reguläres Neuronen- oder Astrozytenkulturmedium auf beiden Seiten des zusammengesetzten MCP. Inkubieren Sie die Kammer zwei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius und überprüfen Sie, ob keine Leckage zwischen dem MCP und dem Glas vorliegt.

Untere Schale. Kortikale Neuronenkulturen werden frisch aus Gehirnen von Mäusen im Alter von 14 bis 16 embryonalen Tagen hergestellt. Nach der Dissektion des Mausgehirns entfernen Sie die Meningen vom Kortex unter dem Dissektionsmikroskop.

Verwenden Sie ein Rasiermesser, um das Gewebe in kleine Gewebestücke zu zerkleinern, und geben Sie die zerkleinerten Gewebestücke nach einer Zentrifugation in ein Reagenzglas. Entsorgen Sie das Überstandmedium und geben Sie 0,05 % Try für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in ein Wasserbad. Lösen Sie die Zellen vorsichtig durch Schütteln mit einer feuerpolierten Pasteur-Pipette.

Lassen Sie die Probe durch einen 70-Mikron-Filter laufen, um mittels Neuronenplattierung eine klare neuronale Zellsuspension zu gewinnen. Medium, ergänzt mit 5 % FBS, zum Ansäen verwendet. 150 Mikroliter Neuronen auf der rechten Seite der zusammengesetzten MCP-Platte.

Eine hohe Dichte an Neuronen, da nur die Neuronen, die sich im Zellretentionsbereich festsetzen, Axone durch die zentralen Kanäle auf die andere Seite des zusammengesetzten MCP ausbilden können. Am folgenden Tag vorsichtig das Medium aus dem Zellansägebereich der Kammer abziehen und das Neuronenansägemedium durch reguläres Neuronenkulturmedium ersetzen.

Medium, geben Sie 20 Nanogramm pro Milliliter glialen abgeleiteten neurotrophen Faktor oder GDNF zur Astrozytenseite der Kammer hinzu. Dadurch entsteht ein chemisches Gradient, der das Auswachsen von Axonen von der neuronalen Seite über die zentralen Kanäle des zusammengesetzten MCP fördert. Überprüfen Sie zwei Tage später, ob Axone in den zentralen Kanal eingetreten sind.

Sobald die Axone in den zentralen Kanal eingedrungen sind, betreten sie normalerweise innerhalb eines Tages die gegenüberliegende Seite. Die Axone sind normalerweise mindestens eine Woche lang intakt, nachdem sie die gegenüberliegende Seite erreicht haben. Ich, nachdem ich das Gehirn von P ein bis drei Maus-Puff-Astrozyten isoliert habe, säte diese in polyurethanbeschichtete 10-Zentimeter-Schalen.

Kultur: Die Zellen über Nacht, ergänzen Sie täglich das Kulturmedium der Astrozyten für die nächsten zwei Tage und danach alle drei Tage, nachdem sieben Tage verstrichen sind und die Astrozyten eine 90 % konfluente Monoschicht gebildet haben. Gewinnen Sie die Zellen mittels Trypsin. Etwa fünf Tage, nachdem die Neuronen ausgesät wurden, aspirations das GDNF ab. Dann säen Sie 150 Mikroliter der resuspendierten Astrozyten in die linke Seite des zusammengesetzten MCP aus. Wenn die Axone kurz davorstehen oder gerade erst eingetreten sind, nach dem erneuten Ausbrüten der Astrozyten, interagieren Axone, die in die linke Seite des zusammengesetzten MCP eingetreten sind, direkt mit den Astrozyten, entweder durch direkten axonalen Kontakt oder durch Freisetzung löslicher Faktoren.

Überwachen Sie die Astrozyten auf ihre Anheftung an den Zellretentionsbereich. Führen Sie eine Immunfärbung der Zellen im kompartimentalisierten Kokultursystem durch, um spezifische Proteine sichtbar zu machen, die beispielsweise an der Interaktion zwischen Axonen und Astrozyten beteiligt sind. Das kompartimentalisierte Neuron-Astrozyten-Kokultursystem ermöglicht es, dass ausschließlich die neuronalen Fortsätze, insbesondere die Axone, gezielt mit Astrozyten interagieren können.

Hier beschreiben wir die axonale induzierte transkriptionelle Aktivierung des glutamathaltigen Transporters von Astroglia. Diese Studien verwenden transgene Mäuse, die eine Expression eines EGF-Fluoreszenzreporters unter Kontrolle des GT-eins-Genompromotors aufweisen. Eine hohe Dichte an Neuronen wird im Zellretentionsbereich des zusammengesetzten MCPA kultiviert; die vergrößerte Ansicht zeigt die Axone, die die zentralen Kanäle durchqueren und auf die andere Seite eintreten, wobei die Färbung gegen Beta-3-Tubulin das Wachstumskegel der Axone offenbart.

Das MCP-System ermöglicht die Beobachtung der Axonbündel, während sie durch den zentralen Kanal wachsen und die gegenüberliegende Seite erreichen. Immunfärbungen für GT1 identifizieren Astrozyten auf der glialen Seite des MCP-Systems. Das Bild zeigt hier den Kontakt zwischen Axonen und GLT1-positiven Astrozyten.

Die Expression des EGFP-Reporters korreliert mit der endogenen GT one-Promotoraktivierung, Proteinexpression und funktionellen Aktivität. Die Beurteilung der GT one-Promotoraktivität in einzelnen Astrozyten in C two zeigt eine signifikant erhöhte GLT one-Immunreaktivität im kompartimentalisierten Kokultursystem. Wichtig ist, dass das MCP-System Zeitrafferaufnahmen ermöglicht, um dynamische Veränderungen zu überwachen.

Zum Beispiel zeigen diese Daten eine durch Axone induzierte Aktivierung des GT1-Promotors mit rückgekoppeltem GT1-EGFP in Astrozyten und Wildtyp-Neuronen einen Tag nach dem Ansäen der Astrozyten. Minimalste EGFP-Fluoreszenz ist zu beobachten. Die EGFP-Intensität nimmt signifikant 48 Stunden nach der Kokultur zu, wenn die Axone bereits weit in den Bereich der Astrozyten vorgedrungen sind und hier direkt mit den Astrozyten in Kontakt stehen.

Die Behandlung mit Chinin auf der neuronalen Seite des zusammengesetzten MCP induzierte den Tod neuronaler Zellen. Interessanterweise führte sie auch zu einer Axonretraktion und -degeneration sowie zu einer Abnahme der axonalen EGFP-Fluoreszenz. Diese dynamischen Änderungen der EGFP-Fluoreszenzintensität als Reaktion auf die Axone zeigten eindeutig, dass die Promotoraktivität von Astroglia GT1 durch die Wechselwirkung mit Axonen moduliert wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Kernkultursystem unter Verwendung der mikrofluidischen Kulturplattform etabliert. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb weniger Tage korrekt durchgeführt werden.