Trans-vivo Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ Assay für Antigen-spezifische Verordnung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mit dem trans vivo DTH-Assay sowohl pro- als auch antiinflammatorische antigenspezifische Reaktionen bei menschlichen Probanden zu überwachen. Zunächst werden periphere mononukleäre Blutzellen aus dem peripheren Blut des menschlichen Probanden isoliert. Anschließend wird die PBMC-Präparation mit PBS gemischt.

Rekall-Antigen-Testantigen und Testantigen plus Rekall-Antigen. Führen Sie die Fußpolster-Vormessungen durch und injizieren Sie die vorbereiteten Mischungen in die Skid-Mäuse. Wiederholen Sie die Fußpolster-Messungen 24 Stunden später. Drei.

Definitive Muster von DTH-Reaktionen können regulierend, nicht-regulierend oder sensibilisiert sein. Der trans vivo-Test für verzögerte Hypersensitivität kann angewendet werden, um klinische Parameter wie alloreaktive Reaktionen zu bestimmen, wobei die Quelle des Antigens die Zellen des Transplantatspenders sind. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden In-vitro-Methoden liegt darin, dass sowohl proinflammatorische als auch regulatorische Reaktionen auf Alloantigene, Autoantigene oder Tumorantigene mithilfe eines einzigen Testsystems leicht nachgewiesen werden können.

Egon, ein Forscher in meinem Labor, wird nun das Verfahren demonstrieren, wobei frisches humanes peripheres Blut, das in Röhrchen mit ACD (Acid Citrate Dextrose) gesammelt wurde, um eine Thrombozytenaktivierung zu vermeiden, verwendet wird. Isolieren Sie PBMCs mit Lymphozyten-Separationsmedium gemäß Standardmethoden. Waschen Sie die PBMC-Präparation mit PBS, um kontaminierende Thrombozyten zu entfernen.

Wenn eine deutliche Kontamination mit roten Blutkörperchen vorliegt, lysieren Sie diese mithilfe eines CK-Lysepuffers. Führen Sie anschließend zwei weitere Waschschritte mit PBS Resus durch. Suspendieren Sie die PBMC in PBS mit einer Konzentration von 10 Millionen PBMC pro Milliliter für das allo Antigen.

Beginnen Sie mit P-BMCs, die aus dem peripheren Blut des Spenders mithilfe des zuvor gezeigten Verfahrens isoliert wurden. Resuspendieren Sie anschließend die Spenderzellen in PBS mit einer Konzentration von 120 Millionen Zellen pro Milliliter und geben Sie ein Mikromolar PMSF hinzu, um den Proteinabbau zu verhindern.

Sonifizieren Sie nun die Zellsuspension mit sieben Impulsen zu je einer Sekunde mit einem zwei Millimeter großen Sondensonicatoren. Überprüfen Sie mithilfe eines Hämozytometers die Zerstörung von mehr als 90 % der Zellen.

Zentrifugieren Sie danach die Mischung bei 14.000 U/min bei vier Grad Celsius für 20 Minuten. Überführen Sie vorsichtig den Überstand in ein zwei Safe-Lock-Röhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit Standardmethoden für jede Injektion. Aliquotieren Sie siebenmal 10 hoch sechs P BMCs in zwei Milliliter.

Sichere Lock-Röhrchen pelletieren die Zellen durch Zentrifugation. Bereiten Sie zunächst die negative Kontrollsuspension von PBMC in 35 µL PBS vor. Fügen Sie dann für die positive Kontrolle 25 µL eines Erinnerungsantigens, Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid, hinzu und stellen Sie das Injektionsvolumen durch Zugabe von PBS auf 35 µL ein.

Entsprechend dem experimentellen Design zur Evaluierung der donorspezifischen Reaktion das Zellpellet in 10 µL Donorantigen und 25 µL PBS für ein Gesamtvolumen von 35 µL resuspendieren. Zur Evaluierung der experimentellen, donorspezifischen Regulation das Zellpellet durch Zugabe von 10 µL Donorantigen und 25 µL Rekall-TT-DT-Antigen in 35 µL resuspendieren. Nach der Anästhesie der Maus mit Isofluran einen federbelasteten Messschieber in der Fußsohlenmitte ansetzen, wobei eine Kante des Messschiebers die letzte begehbare Sohle des Fußes berührt, um eine Referenzmarke zu schaffen, die eine konsistente Messposition gewährleistet, sobald die Anzeige des Messgeräts stabil ist.

Notieren Sie die Ausgangsdicke der Fußpolster für die Injektion in das Fußpolster. Halten Sie die Spritze so, dass die Nadel in Richtung der Zehen zeigt und die Schräge nach oben weist. Führen Sie nun subkutane Injektionen jeder Zellsuspension in die hinteren Fußpolster der Maus durch.

Nummer eins, injizieren Sie langsam das rechte Fußpolster mit der Negativkontrollpräparation. Danach injizieren Sie das linke Fußpolster mit der Positivkontrolle aus PBMC plus TT dt. Bringen Sie die Maus nun in ihren Käfig zurück.

Punkt zwei: Spritzen Sie den rechten Fußpolster mit PBMC plus allo Antigen und den linken Fußpolster mit PBMC plus allo Antigen plus TT dt ein. Stellen Sie sicher, dass 18 bis 24 Stunden nach der Injektion kein Austritt erfolgt. Betäuben Sie jede Maus mit Isofluran und wiederholen Sie die Messung der Schwellung des Fußpolsters.

Subtrahieren Sie die Dicke jedes Fußpolsters vor der Injektion vom Wert nach der Injektion, um den Wert der Fußpolsterschwellung zu erhalten. Berechnen Sie anschließend die antigenspezifische Netto-Schwellung, indem Sie den Kontrollwert der Fußpolsterschwellung von den aus den Behandlungen erhaltenen Werten der Fußpolsterschwellung subtrahieren. Überprüfen Sie den positiven Kontrollwert anhand einer positiven Kontrollreaktion auf das Erinnerungsantigen TT DT von größer oder gleich 25 mal 10 hoch minus vier Zoll über.

Die Hintergrundreaktion auf PBS ist erforderlich, damit der Test als gültig angesehen werden kann. Anschließend bestimmen Sie die Hemmung der Erinnerungsreaktionen in Gegenwart von Spenderantigenen. Dieses Experiment bewertet Nierentransplantatempfänger hinsichtlich der spezifischen Reaktion auf Spenderantigene und hinsichtlich der Regulation.

Es gibt drei Hauptmuster der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion bei Transplantatempfängern: regulatorisch, nicht-regulatorisch und sensibilisiert. Alle Patienten zeigten eine starke Reaktion auf das positive Kontrollantigen, das Erinnerungsantigen tt. Patient Nummer 62 weist das regulatorische Muster auf, das sich durch eine schwache Reaktion auf das Spenderantigen und eine deutliche gekoppelte Unterdrückung der Reaktion auf das Erinnerungsantigen in Gegenwart des Spenderantigens auszeichnet.

Dieses Muster wurde mit der Toleranz gegenüber Organallotransplantaten in Verbindung gebracht. Patient Nummer 48 weist ein nicht-regulatorisches Muster auf, das durch eine schwache Reaktion auf den Spender, jedoch ohne gekoppelte Suppression, gekennzeichnet ist. Dieses Muster wurde häufig bei Patienten beobachtet, die immunsuppressive Medikamente einnehmen.

Patient Nummer acht weist das donor-sensibilisierte Muster auf, das durch eine starke Reaktion auf das Spenderantigen und das Fehlen einer verknüpften Suppression gekennzeichnet ist. Diese Reaktion ist mit der Abstoßung des Transplantats assoziiert. In klinischen Fallstudien wurden P-BMCs von Probanden, die in eine Beobachtungsstudie eingeschlossen wurden, auf donor-spezifische indirekte Signalwege sowie auf T-Effektor- und T-regulatorische Reaktionen untersucht, um die Rolle der donor-spezifischen Regulation bei der klinischen Toleranz zu bewerten.

Die indirekten T-Zell-Antworten auf Spenderantigene zeigen ein unterschiedliches Spektrum zwischen den Einrekrupierungsgruppen. Die Schwellung der Fußpolster nimmt zu, je mehr der klinische Zustand des Patienten sich von Toleranz hin zur chronischen Abstoßung verändert. Hier misst der verknüpfte Suppressionsassay den indirekten anti-donor Weg der T-regulatorischen Antwort.

Diese Daten zeigen eine Abnahme der regulatorischen Reaktionen im Bereich von den am meisten toleranten Patienten über die intermediären bis hin zu den am wenigsten toleranten, chronisch abstoßenden Patienten. Insgesamt betrachtet scheint die immunologische Regulation, gemessen mittels des trans vivo DTH-Assays, ein wichtiger Mechanismus für die Akzeptanz von Nierentransplantaten zu sein.

Ein aussichtsreiches Forschungsfeld ist die Anwendung des TDTH-Assays zur Überwachung von Autoimmunreaktionen. Unsere Untersuchung zur Rolle von Kollagen Typ V im pathologischen Prozess des Bronchiolitis-obliterans-Syndroms (BOS) ergab, dass das höchste relative Risiko für die Entwicklung eines BOS bei Patienten mit positiver Reaktion auf Kollagen beobachtet wurde. Fünf PBMC von Lungentransplantatempfängern, jedoch nicht von gesunden Kontrollpersonen oder Kollagen.

Vier Patienten mit gutem Weidereaktions-Syndrom nach Nierentransplantation reagierten häufig auf Kollagen Typ V. Der TDTH-Assay kann auch verwendet werden, um die Reaktivität von PBMCs von Krebspatienten gegenüber tumorspezifischen Antigenen zu testen. Beispielsweise könnte das Vorhandensein PAP-spezifischer regulatorischer T-Zellen bei Patienten mit Prostatakarzinom die Antwort auf eine Impfung mit PAP-Antigen begrenzen.

Der TRANSVAAL-DTH-Assay ist ein neuartiger diagnostischer Test mit klinischer Anwendung zur Beurteilung zellvermittelter Immunantworten bei Transplantations-, Krebs- und Autoimmunpatienten. Er ist wertvoll, weil er nicht nur zur Überwachung von T-Effektor-Gedächtnisantworten nützlich ist, sondern auch zur Detektion von T-regulatorischen Antworten eingesetzt werden kann, da er nicht auf einer bestimmten Zytokinmessung zur Erkennung von Effektor- oder regulatorischen T-Zellen beruht. Er ist sehr flexibel und breit anwendbar.