Einfache und effiziente Technik zur Herstellung von Hodenkrebs Zellsuspensionen

In diesem Video wird ein sehr einfaches und effizientes Protokoll vorgestellt, um in nur 15 Minuten eine zelluläre Suspension von Testmaterial von Nagetieren zu erhalten. Die Methode wurde zum Testen von Tests an Mäusen und Ratten an Meerschweinchen angewendet und verwendet eine Meta-Maschine, um das verkapselte Gewebe zu disaggregieren. Nach einer Filtration und Färbung ist das Zellinion bereit für den Durchfluss.

Zytoanalyse oder -sortierung Die Homogenität von Zellpopulationen ist eine Voraussetzung für die Analyse biochemischer und molekularer Ereignisse während der männlichen GA-Differenzierung. Die hodenförmige Heterogenität mit über 30 verschiedenen Zelltypen stellt daher eines der Hauptprobleme bei der Erforschung der molekularen Grundlagen der Spermatogenese von Säugetieren dar. Aus diesem Grund wurden verschiedene Methoden verwendet, um eine Anreicherung an gereinigte Hodenzellpopulationen zu erhalten, einschließlich PU und zentrifugale Illustration.

Der erste Schritt für jede Zelltrennungsmethode ist die Herstellung einer zellulären Suspension. Aktuelle Protokolle sind jedoch in der Regel zeitaufwändig und können den Verlust kurzlebiger Moleküle wie RNAs implizieren, was für die Expressionsanalyse unerwünscht ist. Der Hauptvorteil des hier vorgestellten Protokolls besteht darin, dass die Schritte zwischen der Tiertötung und den spezifischen molekularen Studien im Spermienstadium entfallen, aber gleichzeitig eine gute Qualität und eine hervorragende Zelltyprepräsentation in den zellulären Suspensionen gewährleistet wird.

Das Verfahren wird von Dr. Ana Rodriguez, Forscherin am AL Laboratory, die die Methode entwickelt hat, und Federico San Lopez Durchflusszytometrie, die für die zytometrische Analyse verantwortlich waren, demonstriert. Das Verfahren erfordert ein kleines Gerät, das meach System, mit seinem medidon- und fcon-Zubehör. Das fcon-Zubehör kann jedoch perfekt durch Nylonmembranen der gleichen Porengröße ersetzt werden.

Die einzigen anderen benötigten Materialien und Reagenzien sind Glasaufstrich, zwei Schalen, Schere und Pinzette, eine Drei- bis Fünf-Milliliter-Spritze für die Darmkammer, DMM-Kulturmedium, ergänzt mit 10% fötalem Hustenserum und NDA. Wenn nachgelagerte Anwendungen mit RNA-Manipulationen geplant sind, sollten alle Materialien und Lösungen entsprechend behandelt werden, um das Protokoll durchzuführen. Legen Sie den präparierten Hoden in ein 96-Millimeter-Glas pro gezeigtem Eis, das 10 Milliliter ergänztes Eis namens dm enthält.

Entfernen Sie das TAL Virginia, schneiden Sie den Decap-Hoden auf jeder Seite in quadratische Stücke von zwei bis drei Millimetern. Legen Sie vier bis fünf dieser Stücke zusammen mit einem Milliliter Code, der mit D ergänzt und 50 Sekunden lang im Meta-Maschinensystem verarbeitet wurde, in ein Einweg-Medikament. Jede medizinische Einheit besteht aus einem festen Sieb aus Edelstahl mit etwa hundert sechseckigen Löchern, die von sechs Mikroklingen umgeben sind.

Das Gewebe wird durch einen Metallrotor in der Medikamentenkammer zu jedem Loch gebracht und durch das Passieren der geschärften Löcher und durch das Metallsieb entsegregiert, während eine Mikropumpe unter dem Sieb Flüssigkeit zuführt und die Schalen ausspült. Das Ergebnis in Zellsuspension aus dem Medicon mit einer Drei- bis Fünf-Millimeter-Spritze ohne Nadel zurückgewinnen. Tränken Sie anschließend ein 50-Mikrometer-Falcon- oder Nylonnetz in der gleichen Größe mit einem halben Milliliter Medium und filtrieren Sie die Suspension hindurch.

Wiederholen Sie den Schritt, aber verwenden Sie ein 25-Mikrometer-Nylonnetz oder eine gleichwertige Falcon-Einheit und legen Sie es auf Eis, nehmen Sie ein ALI-Zitat der Zellsuspension, um es in einer Noyer-Kammer zu zählen, und stellen Sie die Zellkonzentration auf ein- bis zweimal 10 bis sieben Zellen pro Milliliter in Kulturmedien ein. Fügen Sie schließlich NDA in einer Endkonzentration von 0,2 % hinzu, um ein Pumpen der Zellen zu vermeiden und auch um Muskelverstopfungen bei nachfolgenden Flow-Studien zu vermeiden. Wenn die Lebensfähigkeit von Zellen bewertet werden soll, kann dies mit Hilfe des Kits für die Lebensfähigkeit lebender toter tierischer Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor der durchflusszytometrischen Analyse unter Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffs erfolgen.

Die Wahl des Fluorochroms hängt von den verfügbaren Lasern ab. In dieser Demonstration wird die Verwendung verschiedener Farbstoffe gezeigt, die das Dokument an die DNA binden. Obwohl Propidium yo Diet der übliche Farbstoff für fixierte oder tote Zellen in niedrigen Konzentrationen ist, haben wir festgestellt, dass das ROM bei hohen Konzentrationen in die nicht fixierten Hodenzellen in den Suspensionen eindringt, die nach dem hier vorgestellten Verfahren hergestellt wurden.

Dies ist wahrscheinlich auf die damit verbundene mechanische Belastung zurückzuführen, die in Kombination mit der sensorischen Natur des Samenepithels zum Bruch von Zell-zu-Zell-Verbindungsbrücken mit minimaler Manipulation führen könnte. Für die Propidiumiodid-Färbung 10 Minuten vor der Probenanalyse an der Lösung bei einer Endkonzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter zur Zellsuspension und zur Inkubation bei null Grad Celsius im Dunkeln Zur Analyse von Propidium-mu-Färbezellen. Für die weitere Sortierung verwenden wir ein Fax-Vantage-Durchflusszytometer, das mit einem kohärenten Targon-Ionenlaser ausgestattet ist, der auf eine Emission von 488 Nanometern abgestimmt ist. Die Laserleistung ist auf hundert Milliwatt eingestellt und die emittierte Propidium-I-Fluoreszenz wird über einen FL-Detektor mit einem 5-, 7-, 5-, Slash-26-Bandpassfilter gesammelt.

Verwenden Sie eine 70-Mikrometer-Düse für Durchflusszytometrie-Messungen und eine Squa-Software, um die folgenden Parameter zu analysieren. Vorwärtsstreuung, Streuung, gesamte emittierte Fluoreszenz- oder Pulsfläche und Dauer der Fluoreszenzemission oder Pulsbreite. Die Ergebnisse werden in Gramm dargestellt, die die Anzahl der Ereignisse auf jeder Fluoreszenzebene darstellen, und in D-Diagrammen, die die Seitenstreuung im Vergleich zur Fluoreszenzpulsfläche und die Fluoreszenzpulsfläche im Verhältnis zu ihrer Breite anzeigen.

Dubletten werden von der Analyse ausgeschlossen, indem DO-Plots des Fluoreszenzpulsbereichs in Abhängigkeit von seiner Breite für die Sortierung von SM-Monozytenpopulationen verwendet werden, wobei der Sortiermodus mit dem Fax-Vantage-Set in normalem R oder normalem C eingestellt wird und drei sortierte Tropfen als Hüllkurve verwendet werden. Passen Sie die Probendifferenz an, um Zellen mit einer Rate von 500 bis 1500 pro Sekunde zu analysieren. Bewahren Sie Proben- und Entnahmeröhrchen mit einem Kühlaggregat drei bis vier Grad Celsius auf.

Alternativ können Zellen in der Suspension mit anderen Fluorochromen gefärbt werden. Zum Beispiel der lebenswichtige Farbstoff. HER 3 3 3 4 2 kann bis zu einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter verwendet und für Hirsch mindestens 10 Minuten bei 37 Grad lichtgeschützt inkubiert werden.

3, 3, 3, 4, 2 Fleckenproben. Die Zellanalyse wurde mit Hilfe eines MO-Durchflusszytometers durchgeführt, das mit einem UV-Anregungswellenlängenlaser mit 25 Milliwatt und einer 70-Mikrometer-Düse ausgestattet ist. Verwenden Sie die Software Summit 4.3 oder ähnliches, um die gleichen Parameter zu analysieren, die zuvor angezeigt wurden: Bei der Analyse der Zellsuspensionen unter Gesichtskontrastoptik werden Suspensionen in Schnittqualität beobachtet.

Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind in erster Linie Hodenzellsuspensionen, die mit Hilfe der vielen Maschinen hergestellt werden und nur 15 Minuten einschließlich Testkaiserschnitt, Gewebeschnitt, Ach, maschineller Verarbeitung und Filtration erhalten, in dieser Zeitspanne etwa ein Achtel der Zeit, die andere Protokolle normalerweise benötigen. Die Kürze dieses Protokolls in Verbindung mit einem minimalen Handaufwand würde die gute Konservierung von Makromolekülen mit kurzer Lebensdauer berücksichtigen, was entscheidend ist, wenn eine repräsentative Probe von Verbindungen in der ursprünglichen Zellpopulation erforderlich ist. Da das Methan nur minimal gehandhabt werden muss, ist es in dieser Tabelle leicht reproduzierbar.

Die relativen Prozentsätze der verschiedenen Hodenzellpopulationen für sieben unabhängige Experimente, die mit adulten Ratten durchgeführt und mittels Durchflusszytometrie analysiert wurden, werden als Beispiel vorgestellt, um die Reproduzierbarkeit der Methode zu zeigen. Im Gegensatz zu den meisten derzeit verwendeten Partikeln zur Herstellung von Hodenzellsuspensionen beinhaltet das hier vorgestellte Verfahren keine enzymatische Wirkung. Obwohl Kollagenase-Tropfen in RNAs, die die allgemein enthaltenen Enzyme sind, zur unzureichenden Segregation des Gewebes beitragen, können sie die Erhaltung von Makromolekülen von Interesse beeinflussen.

Der Mangel an enzymatischen Behandlungen begünstigt nicht nur die RNA- und Proteinkonservierung, sondern macht ein Protokoll auch billiger. Obwohl bereits zuvor berichtet worden war, dass mechanisch hergestellte Zellsuspensionen leichter verklumpten als Tryps-inisierte Zellsuspensionen, haben wir festgestellt, dass dieses Protokoll in Abwesenheit enzymatischer Wirkung zu gut entsegregierten Zellsuspensionen führt. Die Aufnahme von NDA hat sich als sehr hilfreich erwiesen, um Zellverklumpungen zu verhindern.

Die gute Qualität der Suspensionen wird auch bei der zytometrischen Analyse der Proben nachgewiesen, die anhand der minimalen beobachteten Zelltrümmer beurteilt wird. Nach veröffentlichten Informationen werden etwa 13% der runden Spermien als mehrkernige Spermien gefunden, entweder wenn die Zellsuspensionen durch ein ausschließlich mechanisches Verfahren hergestellt werden oder in Gegenwart von Trypsin. Viele maschinell hergestellte Suspensionen machen jedoch sehr seltene Mehrkerne, höchstwahrscheinlich aufgrund einer geringeren Verwicklung, da festgestellt wurde, dass Mehrkerne hauptsächlich als Folge von Gewebemanipulationen produziert werden.

In diesem Bild ist ein Beispiel für eine viele maschinell präparierte Zellsuspension aus Rattenhoden zu sehen. Wie man sehen kann. Zytoplasmen sind gut erhalten: Die relativen Prozentsätze von C-, Zwei- und Vier-C-Zellpopulationen in vielen maschinell hergestellten Hodensuspensionen für verschiedene Nagetiere setzten die der intakten PEs wieder zusammen.

Dies spricht für die Annahme, dass die hier beschriebene Methode keinen bestimmten Zelltyp selektiv schädigt. Überraschenderweise ist die Darstellung des Zelltyps in vielen maschinell hergestellten Suspensionen viel besser erhalten als bei den klassischen Dripin-Präparationsmethoden. Wie zu sehen ist, weichen die Zytographiken, die für meine prozessierten Hodenzellsuspensionen erhalten wurden, nicht wesentlich von den zuvor berichteten ab.

Tatsächlich zeigen die erhaltenen Histogramme und Punktdiagramme die drei charakteristischen vier Hodenzellpopulationen C bis C und C basierend auf dem DNA-Gehalt sowie die anscheinend subha-Population, die die hochkondensierten haploiden Spermien darstellt. Diese Profile wurden entweder für ihre anhaltenden bzw. Propidiumiodid-Fleckensuspensionen beobachtet, und dies gilt sowohl für adulte als auch für juvenile Exemplare. Die Sortierung von mitogenen Sperzellen wurde erfolgreich mit einer Reinheit von über 98 % erreicht, entweder für ausgewählte Hodenpopulationen basierend auf dem DNA-Gehalt oder sogar für Subpopulationen mit dem gleichen DNA-Gehalt, aber unterschiedlichem Chromatinkondensationsniveau wie Schlafzinken und Zinkenmyozyten.

Wie wir bei Meerschweinchen-Testsuspensionen beobachten konnten, weisen sortierte Populationen, da das Protokoll keine RNA-Behandlung umfasst, eine gute RNA-Qualität auf und ermöglichen unterschiedliche Genexpressionsstudien auch für Propidiumiodid-gefärbte Populationen. In diesem Sinne ist es erwähnenswert, dass im Gegensatz zu anderen Farbstoffen, Propidiumiodid-Färbungen, DNA sowie doppelsträngiger RNA in dieser Grafik einer Meerschweinchen-Hodensuspensionsanalyse jedoch die ähnlichen Profile unter Verwendung von Propidiumiodid parallel zu einem lebendigen Zyklus Orange erhalten werden. Das ist ein wichtiger DNA-spezifischer Farbstoff, der zeigt, dass die RNA-Färbung die zytometrischen Histogrammmuster nicht signifikant beeinflusst.

Diese Liste fasst die wichtigsten Vorteile des prozentualen Protokolls zusammen. Das hier beschriebene optimierte Verfahren ermöglicht es, die Herstellung geeigneter Hodenzellsuspensionen für die zytometrische Analyse verschiedener Spermienstadien von Nagetieren in nur 15 Minuten zu beschleunigen, einschließlich Hodendissektion, Gewebeschnitt und Verarbeitung durch das ME-Maschinensystem. Die Kürze, die höhere Reproduzierbarkeit und die Zelltypanteile in den Zellsuspensionen machen es zu einer guten Alternative zu anderen, mühsameren und zeitaufwändigeren Selbstpräparationstechniken, die derzeit im Einsatz sind.

Da diese Methode nur sehr wenig Manipulation erfordert und Enzyme und Detergenzien vermeidet, ist sie außerdem eine ideale Wahl für empfindliche nachgelagerte Anwendungen wie Genexpressionsstudien.