Mechanische Stimulation induzierte Calcium Wellenausbreitung in Zellmonoschichten: Das Beispiel Bovine Endothelzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die interzelluläre Kommunikation über Gap-Junction-Kanäle und HEMI-Kanäle zu untersuchen, indem die Ausbreitung der interzellulären Kalziumwelle, die durch mechanische Stimulation in Monoschichten primärer Hornhautendothelzellen hervorgerufen wird, quantifiziert wird. Dies wird erreicht, indem zunächst die primären Hornhautendothelzellen aus frischen Rinderaugen isoliert werden. In einem zweiten Schritt wird zwei bis drei Tage nach der Aussaat in kammerförmigen Objektträgern die konfluente Monoschicht der Zellen mit dem fluoreszierenden Kalzium-sensitiven Farbstoff flu O 4:00 AM beladen. Als nächstes wenden wir einen kontrollierten und lokalisierten mechanischen Stimulus an eine einzelne Zelle der Monoschicht an, um eine interzelluläre Kalziumwelle hervorzurufen, die auf dem konfokalen Mikroskop sichtbar gemacht wird.

Die Ergebnisse zeigen die Ausbreitung der interzellulären Kalziumwellenausbreitung. Letztendlich wird die Hemmung von Gap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen verwendet, um die Eigenschaften und die Regulation verschiedener Conex und Panex und Isoformen zu entschlüsseln, die Gap-Junction-Kanäle und HEMI-Kanäle bilden. Der Hauptvorteil der mechanisch stimulierungsinduzierten interzellulären Kalziumwellenausbreitung besteht darin, dass sie eine einfache und zuverlässige Methode zur Untersuchung des Beitrags und der Eigenschaften von Verbindungs- und Axtkanälen auf nicht-invasive Weise bietet.

Darüber hinaus stützt sich die Methode auf die physiologischen Signalmoleküle und Kaskaden, die in den untersuchten zellulären Systemen vorhanden sind. Schließlich ist es leicht an eine Vielzahl von Zellsystemen anpassbar, einschließlich Primärzellen und Zellmodellen, die ektopisch bestimmte Bindungs- oder PanIN-Isoformen exprimieren. Diese Methode kann Einblicke in die Funktion und dynamische Regulation von Verbindungs- und PanIN-basierten Cap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen durch die Verwendung von SI-RNA-vermitteltem Knockdown von endogenen Bindungen oder Paniken in Isoformen und durch die Verwendung selektiver Inhibitoren von Cap-Junction-Kanälen und HEMI-Kanälen geben.

Dieses System ist definitiv nicht auf beide Hornhaut-Endothelzellen beschränkt. Es ist anpassungsfähig an praktisch jeden Zelltyp und auch an komplexere Gewebe. Bei diesem Verfahren wird ein frisch entnommenes Auge von einer Kuh verwendet, die nicht älter als 18 Monate ist und nicht länger als fünf Minuten nach dem Tod ist.

Das wurde in Earl's Balance Salzlösung und 1%iger Jodlösung bei vier Grad Celsius ins Labor transportiert. Übertragen Sie zunächst das Auge in eine 100 Millimeter x 20 Millimeter große Petrischale. Spülen Sie anschließend das Auge mit EBSS mit 1% Jod.

Sterilisieren Sie es dann ab diesem Zeitpunkt mit einer Lösung, die 70% Ethanol enthält. Arbeiten Sie in einer sterilen Haube. Präparieren Sie vorsichtig die Hornhaut aus dem Auge und legen Sie sie mit der Epithelzellschicht nach oben in eine 35 Millimeter x 10 Millimeter große Petrischale, die EBSS enthält.

Entfernen Sie vorsichtig das restliche Irisgewebe, das noch an der Hornhaut haftet. Übertragen Sie die Hornhaut bei Bedarf mit der Endothelzellschicht nach oben in eine andere Schale mit EBSS und spülen Sie sie dann zweimal mit EBSS aus. Legen Sie dann die Hornhaut mit der Endothelschicht nach oben in eine Sanduhr und bedecken Sie sie mit Wachstumsmedium.

Zum Spülen das Medium mit einer Saugpipette entfernen. Tragen Sie 300 Mikroliter 0,5 Gramm pro Liter Tripsin-Lösung auf die Endothelschicht der Hornhaut auf. Legen Sie die Sanduhr mit der Hornhaut in eine abgedeckte Petrischale und stellen Sie sie für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator.

Nachdem Sie die Sanduhr entnommen hatten, kratzten Sie die Endothelzellen vorsichtig mit einer feuerpolierten, hakenförmigen Glaspipette von der Hornhaut ab. Die Lösung, die die Endothelzellen enthält, wird aspiriert und in einen 25 cm großen quadratischen Kulturkolben gegeben, der vier Milliliter Kulturmedium enthält. Tragen Sie anschließend 300 Mikroliter Wachstumsmedium auf die Hornhaut auf.

Wiederholen Sie das Schaben und geben Sie die Lösung, die die Endothelzellen enthält, in den Kulturkolben. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal und legen Sie dann die Kulturflaschen mit den Hornhautendothelzellen in das Wachstumsmedium im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Fügen Sie zwei Tage später sechs Milliliter Nährmedium hinzu und erneuern Sie das Nährmedium jeden zweiten Tag.

Die Zellen sollten innerhalb von sieben bis 10 Tagen nach der Isolierung bis zur Passage konfluent sein. Aspirieren Sie zuerst das Kulturmedium und spülen Sie es dann zweimal mit EBSS. Geben Sie dann zwei Milliliter Trips in Lösung zu den Zellen und stellen Sie den Kolben für drei bis vier Minuten in den Inkubator.

Fügen Sie dann 12 Milliliter Wachstumsmedium hinzu und pipettieren Sie das Medium dreimal ein und aus, um die Zellen zu dispergieren. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämometer, Zytometer oder einem automatisierten Zellzähler. Geben Sie 165.000 Zellen in zwei Vertiefungskultur-Objektträger.

Bereiten Sie anschließend 75 Zentimeter große Kulturgefäße für einen neuen Durchgang bei einer Dichte von 6.250 Zellen pro Quadratzentimeter vor und fügen Sie frisches Kulturmedium bis zu einem Gesamtvolumen von 25 Millilitern hinzu und legen Sie die Kolben und Kammerobjektträger in den Inkubator. Das Medium wird alle zwei Tage aufgefrischt und die Kofluenz der Zellschicht sollte innerhalb von drei bis vier Tagen erreicht sein. Laden Sie zuerst die Zellen in den Kammerobjektträger mit 10 mikromolaren Grippe oh 4:00 Uhr in phosphatgepufferter Kochsalzlösung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter leichtem Schütteln, während die Zellen in Grippe oh 4:00 Uhr inkubieren. Koppeln Sie eine Glasmikropipette mit einem Spitzendurchmesser von weniger als einem Mikrometer an einen Piso-Elektrokristall-Nanopositionierer. und an einen Verstärker anschließen, der auf einem Mikromanipulator montiert ist.

Stellen Sie die Spannung des Nano-Positionierers auf 0,2 bis 1,5 Volt ein. Entfernen Sie die Grippe der 4:00 Uhr Lösung. Waschen Sie dann die Zellen fünfmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung und inkubieren Sie die Zellen dann vor der Messung mindestens fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS.

Angeregt 488 Nanometer mit Argonnenlaser und Verwendung des Strahlteilers HFT 48. Sammeln Sie die Fluoreszenzemission bei 530 Nanometern mit einem Langpass-Emissionsfilter, LP 5 0 5 mit mindestens eingestellter Lochblende, hier wird ein 40-fach-Objektiv für die Ölimmersion verwendet. Platzieren Sie den Objektträger auf dem Tisch eines konfokalen Mikroskops und suchen Sie einen Bereich mit Konfluenzzellen.

Bewegen Sie als Nächstes den Mikromanipulator, um die Glasmikropipette so zu positionieren, dass sie die Zellmembran in einem Winkel von 45 Grad berührt. Betätigen Sie den Mikromanipulator, um mit der Mikropipette aus Glas kurz weniger als 1 % der Einzelzellmembran zu berühren und eine einsekündige mechanische Stimulation der Zelle zu provozieren. Messen Sie dann räumliche Veränderungen der Kalziumionenkonzentration nach mechanischer Stimulation mit einem konfokalen Mikroskop, sammeln und speichern Sie Bilder.

Zeichnen Sie abschließend einen polygonalen Bereich von Interesse, um die Gesamtoberfläche der responsiven Zellen mit der Software des konfokalen Mikroskops zu definieren. Mechanisch stimulationsinduzierte Calciumtransienten werden zu verschiedenen Zeitpunkten unter Kontrollbedingungen in Rinderhornhaut-Endothelzellen durch repräsentative pseudofarbige Fluoreszenzbilder dargestellt, die Fluoreszenzintensitäten vor der Stimulation sind im ersten Bild dargestellt. Der weiße Pfeil im zweiten Bild kennzeichnet die mechanisch stimulierte Zelle.

Die Kalziumwelle breitet sich auf sechs benachbarte Zellschichten aus, wobei die Gesamtfläche der von der Welle erreichten Zellen eine aktive Fläche von 62.870 Mikrometern im Quadrat ergibt. Das Liniendiagramm zeigt den zeitlichen Verlauf des normierten Fluoreszenzwerts oder NF in der mechanisch stimulierten Zelle mit ms und den Durchschnittswert von NF in den benachbarten Zellschichten eins bis fünf, die in der Grafik als MB eins bis fünf gekennzeichnet sind. Diese Bilder zeigen signifikante Veränderungen in der Ausbreitung interzellulärer Calciumwellen nach Behandlung mit exogenen Nukleotiden in der Grafik links und nach Behandlung mit Ecto-Nukleotid-Aase-Inhibitoren in der Grafik rechts, die Grafik auf der linken Seite zeigt eine signifikante Abnahme der aktiven Fläche nach Behandlung von Rinderhornhaut-Endothelzellen mit den exogenen Aras Aase sechs und Aase sieben, die A TP und A DP hydrolysierten, wodurch der perikrine interzelluläre Kommunikationsweg gehemmt wurde.

Das Sternchen steht für einen P-Wert von weniger als 0,001 in Gegenwart und Abwesenheit von Ass. Die Grafik auf der rechten Seite zeigt eine signifikante Zunahme der aktiven Fläche nach der Behandlung von BCEC mit einem selektiven Ekto-Nukleotid-Inhibitor, A RL 6 7 1 56, wodurch der perikrine interzelluläre Kommunikationsweg verbessert wird. Das Sternchen steht für einen P-Wert von weniger als 0,001 im Vorhandensein oder Fehlen einer RL Nach der Beherrschung.

Diese Technik kann in fünf bis 10 Minuten für ein Experiment unter einem bestimmten Zustand durchgeführt werden, wenn es richtig ausgeführt wird. Die Durchführung einer ganzen Reihe von Experimenten, aus denen man verschiedene Bedingungen vergleichen kann, dauert einen Tag, um statistische Schlussfolgerungen zu ziehen. Es müssen unabhängige Experimente verwendet werden, die an verschiedenen Tagen und mit verschiedenen Chargen isolierter Zellen durchgeführt wurden.

Die Messung und Quantifizierung der intrazellulären Calciumwellenausbreitung ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung der zellbiologischen Regulation verschiedener Verbindungs- und Isoformen wie Gab-Junction-Kanäle und HEMI-Kanäle. Ich möchte auch hervorheben, dass diese Methode nicht für sich allein steht, sondern durch andere molekulare und funktionelle Ansätze ergänzt werden sollte, die von der Futterübertragung über eine TP-Freisetzung bis hin zur Elektrophysiologie reichen.