Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Seneszenz von Zellen schnell und sensitiv zu quantifizieren. Hier zeigen wir den Nutzen dieser Methode beim Screening potenzieller Chemotherapeutika. Erste, die zelluläre Seneszenz induziert.

Das Chemotherapeutikum Doxorubicin wird Krebszellen zugesetzt. Als nächstes wird Bain A One aufgetragen, um den sauren pH-Wert der zellulären Lysosomen zu neutralisieren. Dann wird bei zellulärer Aufnahme das Zellpermeat-Beta-Galacto-Substrat C 12 FDG zugesetzt.

Das C 12 FDG ist hydrolysiert und fluoresziert. Da Beta-GCSEs in Lysosomen seneszenter Zellen angereichert sind, werden sie fluoreszierender als nicht seneszente Zellen. Um den Unterschied in der Fluoreszenz zu quantifizieren, werden die Zellen auf einem Durchflusszytometer durchgeführt. Die Analyse der resultierenden Daten ermöglicht die Quantifizierung des Prozentsatzes seneszenter Krebszellen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Beta-Galaktose besteht darin, dass sie eine schnelle und empfindliche Quantifizierung seneszenter Zellen ermöglicht. Tatsächlich fügen wir die Idee für diese Methode erst hinzu, wenn wir Schwierigkeiten haben, seneszente Zellen mit der häufig verwendeten Beta-Galaktose zu quantifizieren. Obwohl wir diese Technik verwenden, um Seneszenz auf Krebszellen zu erkennen, kann sie auch auf normale Zellen angewendet werden.

Diese Methode kann helfen, schnelle Fragen im Krebsbereich zu beantworten, z. B. ob ein Chemotherapeutikum Krebszellen zu SSE induziert, was Malignität fördern könnte. Daher könnte diese Technik letztendlich dazu beitragen, neue therapeutische Behandlungen für Krebs zu melden. Bei der Arbeit in einem chemischen Abzug löste sich das C 12 FDG-Pulver in DMSO auf eine Endkonzentration von 20 Millimolar aliquot in 0,5 Milliliter Einorröhrchen und lagerte es bei minus 80 Grad Celsius.

DMSO sollte unter entsprechenden Sicherheitsbedingungen verwendet werden, auch auflösen. CIN A ein Pulver in DMSO bis zu einer Endkonzentration von 0,1. Millimolar Eloqua die Lösung in 0,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen füllen und bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Beachten Sie, dass die CIN mit angemessenen Sicherheitsvorkehrungen verwendet werden sollte. Dieses Verfahren kann entweder mit adhärenten oder nicht adhärenten Zellen durchgeführt werden. Hier wird das Verfahren anhand der humanen Myelomzelllinie RPMI 8 2 2 6 demonstriert.

Diese Zellen wachsen in Suspension, kultivieren RPMI 8 2 2 6 Zellen in einem Medium, das 10 % FBS und 1 % Antibiotika bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid enthält, 24 Stunden vor der Durchführung des Experiments, säen Sie die Zellen in sechs Well-Platten aus, so dass sie sich in der logarithmischen Phase der zellulären Proliferationskurve befinden. Zum Zeitpunkt des Experiments zur Bestimmung des Prozentsatzes seneszenter Zellen werden drei Zellproben benötigt. Unbehandelte und nicht ST-gefärbte Zellen, unbehandelte Zellen, die mit C 12 FDG gefärbt wurden, und behandelte Zellen, die mit C 12 FTG gefärbt wurden.

Für jede Erkrankung sind mindestens fünf mal 10 bis fünfte Zellen für die Durchflusszytometrie-induzierte Seneszenz von Krebszellen erforderlich. Durch die Zugabe des Chemotherapeutikums Doxorubicin sollten die Wirkstoffkonzentration und die Dauer der Behandlung an den Zelltyp angepasst werden. Getestet für rpmi 8 2 2 6 Zellen.

Seneszenz kann induziert werden, indem 10 der sechs Zellen pro Milliliter 48 Stunden lang mit 15 nanomolaren Doxorubicin behandelt werden. Vergessen Sie nicht, die unbehandelte Probe als Negativkontrolle bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu inkubieren. Die Behandlung mit Chemotherapeutika kann zur Zellapoptose führen.

Überprüfen Sie daher nach zwei Tagen die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trianblau-Ausschluss mit einem Hämohämo, einem Zytometer und einem Mikroskop. Wenn der Prozentsatz der Lebensfähigkeit weniger als 70 % beträgt, entfernen Sie die toten Zellen mit einem geeigneten Kit, wie z. B. dem Kit zur Entfernung toter Zellen von Milton E, um sicherzustellen, dass tote Zellen die nachfolgende Analyse nicht verzerren. Andernfalls entfernen Sie das Kulturmedium, indem Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 GS herunterdrehen.

Nach dem Entfernen des Überstands bei Prewarm-Frischkulturmedium, das 100 Anom oder Cin enthält, inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und lösen Sie das Beta-Galacto-A-Substrat C 12 FDG in einer Vorkriegs-Frischkultur auf. Mittel bis zu einer Endkonzentration von zwei Millimolaren. Nach der Inkubation mit Beil Mycin.

Geben Sie C 12 FDG direkt in die Zellen und das Medium bis zu einer Endkonzentration von 33. Mikromolare Inkubation für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g bei vier Grad Celsius.

Waschen Sie die Zellen nach dem Schleudern zweimal, wobei PBS jedes Mal wie zuvor herunterschleudert und der Überstand nach dem zweiten Waschen entfernt wird. Resusieren Sie das Zellpellet in 500 Mikrolitern kaltem PBS und führen Sie dann eine Co-Immunmarkierung durch, um die Population seneszenter Zellen weiter zu charakterisieren. Wenn Sie keine Erfahrung mit der Durchflusszytometrie haben, ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens die Durchführung der Durchflusszytometrie-Analyse.

Um den Erfolg sicherzustellen, stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechenden Kontrollen einschließen und suchen Sie bei Bedarf Hilfe von unerfahrenen Personen. Bereiten Sie vor dem Ausführen des ersten Beispiels eine Grafik mit zwei Parametern vor, die den Vorwärts-Scatter-Kanal oder FSC im Vergleich zum Side-Scatter-Kanal SSC anzeigt. Führen Sie dann die erste Stichprobe mit unbeschrifteten Zellen aus.

Stellen Sie die Photomultiplier-Röhren oder PMTs ein und definieren Sie einen Interessenbereich, wobei tote Zellen und zelluläre Trümmer, die während des Probenvorbereitungs-Gates aufgetreten sein könnten, ausgeschlossen werden. Dieser interessierende Bereich in einem Ein-Parameter-Histogramm, das die Fluoreszenz von C 12 FDG als FL eins auf der logarithmischen Skala der x-Achse und die Anzahl der Ereignisse auf der Y-Achse anzeigt. Die Gesamtzahl der Ereignisse stellt die Anzahl der analysierten Zellen dar.

Legen Sie den PMT so fest, dass unbeschriftete Zellen in der ersten Dekade auf der logarithmischen Skala der x-Achse angezeigt werden. Bestimmen Sie bei Bedarf die Autofluoreszenz der Zellen, indem Sie die unmarkierten Zellen in der Strömung laufen lassen. Führen Sie die zweite Probe mit unbehandelten Zellen auf dem Ein-Parameter-Histogramm aus, das FL anzeigt, und platzieren Sie den Cursor nach der schwach beschrifteten Population.

Dieser Schwellenwert ermöglicht die Unterscheidung zwischen nicht-seneszenten Zellen, die schwach markiert sind, und seneszenten Zellen, die hell markiert sind. Führen Sie die dritte Probe mit behandelten Zellen durch. Hell markierte seneszente Zellen erscheinen oberhalb des im vorherigen Schritt festgelegten Schwellenwerts.

Werten Sie den Prozentsatz der seneszenten Zellen aus, indem Sie bei Bedarf die Anzahl der hellen Ereignisse durch die Gesamtzahl der Ereignisse dividieren. Die Aktivität der Beta-Galacto-Tase kann auch anhand der mittleren Fluoreszenzintensität abgeschätzt werden, um die durch ein chemotherapeutisches Verfahren induzierte Seneszenz zu bewerten. Die kommerziell erhältliche multiple Myelom-Zelllinie R RRP I 8 2 2 6 wurde zwei Tage lang mit Doxorubicin, einem Chemotherapeutikum und Assay für Seneszenz, behandelt. Wie in diesem Video beschrieben, zeigen diese Histogramme die Fluoreszenz von unbehandelten Zellen auf der linken Seite und behandelten Zellen auf der rechten Seite.

Eine Population von hell markierten Zellen, die seneszente Zellen repräsentieren, erscheint in der Region V.In parallel, die gleiche Zellprobe wurde mit dem Beta-Galacto-Sase-Assay gefärbt. In diesem repräsentativen Bild sind vollständig blaue und teilweise blaue Zellen dargestellt, um die Schwierigkeit zu verdeutlichen, wirklich blaue seneszente Zellen zu unterscheiden. Um die Spezifität von C 12 FDG bei der Bestimmung des Prozentsatzes seneszenter Zellen zu verdeutlichen, wurden die Zellen zusätzlich mit verschiedenen Konzentrationen von Doxorubicin behandelt.

Der Prozentsatz der seneszenten Zellen wurde bestimmt, indem die Anzahl der hellen Ereignisse dividiert wurde. Bezogen auf die Gesamtzahl der Ereignisse betrug der prozentuale Anteil der seneszenten Zellen 0,8 %, 15,78 % bzw. 26,31 % für eine Dosis von 5, 25 bzw. 50 nanomolaren Doxorubicin. Dies zeigt, dass die C12-FTG-Markierung spezifisch für seneszente Zellen ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie seneszente Zellen durch Durchflusszytometrie seriell oder nicht quantifiziert werden können, wobei dieses Verfahren Methoden wie die Immunmarkierung durchgeführt werden können, um seneszente Zellen zu charakterisieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DMSO oder Krebszellen äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden.