Intravitalmikroskopie zur Imaging subzellulärer Strukturen in lebenden Mäusen Ausdruck Fluoreszierende Proteine

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, subzelluläre Strukturen in den Speicheldrüsen von Mäusen sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Speicheldrüsen chirurgisch freigelegt werden, ohne sie zu beschädigen. Im zweiten Schritt wird das anästhesierte Tier auf dem Mikroskoptisch ruhiggestellt.

Anschließend werden die Speicheldrüsen sorgfältig positioniert, um ihre Funktion im letzten Schritt nicht zu beeinträchtigen. Die Maus ist mit einer speziellen Halterung stabilisiert, um Bewegungsartefakte aufgrund des Herzschlags oder der Atmung des Tieres zu minimieren. Letztendlich kann die Dynamik der subzellulären Strukturen durch Intravitalmikroskopie abgebildet werden.

Wiegen Sie die Mäuse vor der Anästhesie, um die richtige Dosis des Anästhetikums zu bestimmen. Als nächstes wird die Voranästhesie durch Inhalation von Fluor eingeleitet. Sobald die Tiere bewusstlos sind, bestätigen Sie die Sedierung alle 15 Minuten durch Pop-Pinch und halten Sie die Mäuse für die Dauer der Operation unter einer Wärmelampe.

Überwachen Sie die Körpertemperatur der Tiere mit einem rektalen Sondenthermometer. Rasieren Sie nun den Hals der Maus mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und wischen Sie dann mit einem mit Ethanol getränkten Mullschwamm die Bauchseite des Halses ab und trocknen Sie den überschüssigen Alkohol mit dem Kim-Tuch ab. Als nächstes hebst du mit einer stumpfen, gebogenen Pinzette ein kleines Stück Haut am unteren Seitenende der Massitermuskulatur an und machst einen kleinen Schnitt.

Führen Sie die Schere in den Schnitt ein, zeigen Sie mit den Spitzen nach oben zur Unterseite der Haut und öffnen Sie die Klingen mehrmals, bis sich die Haut vom darunter liegenden Gewebe gelöst hat. Beginnen Sie dann in der Nähe der Basis der Speicheldrüsen, wo der Nervengang und die Blutgefäße die Drüse mit dem Rest des Körpers verbinden. Schneide mit der Schere einen drei Millimeter breiten und 10 Millimeter langen Streifen gelockerter Haut ab.

Nach der Reinigung des Wundbereichs ist die resultierende Öffnung oval und misst etwa acht mal 12 Millimeter. Beide Speicheldrüsen sind sichtbar. Trage mit einer Spritze optisches Kopplungsgel in die Mitte des Schnitts auf und wische das Gel dann mit frischen Stücken steriler Gaze nach außen über die Öffnung, bis das gesamte Blut und die losen Haare entfernt sind.

Verwende nun eine Pinzette Nummer sieben, um die Spitze der rechten Speicheldrüse zu finden, und greife das Bindegewebe einige Millimeter über der Oberseite der Drüse. Reißen Sie dann das Bindegewebe um die Drüse ein, ohne das Parenchym zu verletzen. Sobald die Drüse freigelegt ist, trennen Sie vorsichtig das Bindegewebe von der Drüse und waschen Sie alle Blutungen mit Kochsalzlösung weg.

Stellen Sie sicher, dass das gesamte Bindegewebe getrennt ist und die Drüse vollständig freigelegt ist. Bevor Sie das Tier zum Mikroskop bringen, legen Sie ein dickes Stück Gaze und eine Wärmepackung auf den Mikroskoptisch und bedecken Sie die Oberseite der Wärmepackung ebenfalls mit einem dünnen Stück Gaze. Platzieren Sie ein Deckglas über der Mitte der Bühne.

Positionieren Sie dann die Maus auf der rechten Seite auf der Gaze und befestigen Sie das Tier mit einem Stück Kreppband an der Bauchseite der rechten Vorderpfote und einer Seidennaht, die um die Schneidezähne eingehakt wird. Schaffe etwas Spannung zwischen dem Faden und der Pfote und befestige sie auf der Bühne. Mit mehr Kreppband sollte die Speicheldrüse natürlich ruhen.

In der Mitte des Deckglases. Verwenden Sie Kunststoffkeile, die mit dem Mikroskoptisch gekoppelt sind, um den Kopf und den Thorax der Maus weiter zu stabilisieren. Legen Sie dann ein kleines Stück Linsenreinigungstuch über die Drüse.

Verlängern Sie die Verschraubung leicht und platzieren Sie einen individuellen Halter über der Verschraubung. Koppeln Sie dann den Stabilisator mit einer Metallklemme und Kreppband fest an die Bühne. Decken Sie das Tier mit Gaze und einem Wärmekissen ab und überwachen Sie die Temperatur der freiliegenden Drüsen mit einem flexiblen, mit thermisch gekoppelten Sonden ausgestatteten Thermometer. Verwenden Sie unmittelbar nach der Stabilisierung des Tieres eine Epi-Fluoreszenzbeleuchtung, um sich auf die Oberfläche der Drüse zu konzentrieren.

Beurteilen Sie den Blutfluss in den Kapillaren und die Gesamtmorphologie des Gewebes. Um das GFP-Gen anzuregen, verwenden Sie einen 488-Nanometer-Laser. Stellen Sie die Spitzenleistung auf 0,5 Milliwatt ein, um ein Photobleichen für das Tandem-Tomatenprotein zu vermeiden.

Verwenden Sie einen 561-Nanometer-Laser und stellen Sie die Spitzenleistung auf ein Milliwatt ein. Beurteilen Sie nun die Stabilität des Gewebes, indem Sie den ausgewählten Bereich vorab scannen. Wenn das Präparat nicht stabil ist, stellen Sie das Tier entsprechend ein, um die richtige Fokusebene zu finden.

Im Pre-Modus. Bewegen Sie das Objektiv allmählich in Richtung Deckglas, bis die Aser-Strukturen, das sekretorische Granulat und die Plasmamembran deutlich sichtbar werden. Um die Dynamik des sekretorischen Granulats abzubilden, verwenden Sie dann eine Scangeschwindigkeit von 0,5 bis zwei Sekunden pro Bild und 256 x 256 Pixel mit einer räumlichen Skala von 0,2 Mikrometer pro Pixel.

Um das Granulat und die Plasmamembran optimal sichtbar zu machen, stellen Sie die optische Dicke zwischen 0,9 und 1,2 Mikrometer ein. Nehmen Sie als Nächstes ein Bild des Sichtfelds auf, das als Referenzpunkt verwendet werden soll. Stimulieren Sie schließlich die Exozytose, indem Sie 0,1 Milligramm pro Kilogramm frisch zubereitetes Isoproterenol und Kochsalzlösung subkutan injizieren.

Eine Minute nach der Injektion. Die Fusion des sekretorischen Granulats mit der Plasmamembran wird durch eine Erhöhung der GFP-Fluoreszenz um die Granulate und die Diffusion des Tandemtomatenpeptids in ihre begrenzenden Membranen nachgewiesen. In der GFPM-Tomatenmaus erscheinen die Asinin-Strukturen als klar unterscheidbare Strukturen, die zytosolisches GFP und membrangesteuertes Tandem-Tomatenpeptid exprimieren, wie durch die gestrichelten Linien angezeigt.

In einzelnen Asininzellen werden Aserzellen durch das Tandem-Tomatenpeptid abgegrenzt, wie durch die Pfeile angedeutet. GFP wird auch in den Zellkernen nachgewiesen, die im Inneren der Aser-Zellen deutlich sichtbar sind. Zytosolisches GFP, das durch die Pfeilspitze angezeigt wird, wird aus den sekretorischen Granula ausgeschlossen, die als dunkle kreisförmige Vesikel mit einem Durchmesser von etwa einem bis 1,5 Mikrometern erscheinen.

Zur Visualisierung exophytischer Ereignisse wird nach der Injektion des Isoproterenols ein repräsentativer Bereich der Plasmamembran dargestellt, der mit sekretorischen Granulaten angereichert ist, wie durch das Sternchen gekennzeichnet. Es ist ein Anstieg der GFP-Fluoreszenz zu beobachten, der durch die grünen Pfeile um einige der sekretorischen Granula gekennzeichnet ist, die sich in unmittelbarer Nähe der Plasmamembran befinden. Darüber hinaus diffundiert das Tandemtomatenpeptid nach der Fusion mit der Plasmamembran in die begrenzenden Membranen des sekretorischen Granulats, wie durch die roten Pfeile hervorgehoben.

Nach 30 bis 40 Sekunden kollabiert das Sekretärsgranulat allmählich und seine begrenzenden Membranen werden in die apikale Plasmamembran integriert. Der hier vorgestellte Ansatz stellt einen großen Durchbruch in der Zellbiologie dar, da er die Abbildung der Dynamik eines spezifischen Membrantransportprozesses in lebenden Mäusen ermöglicht.