Optimierte Protokolle für Mycobacterium leprae Dehnungs Management: Gefrorene Lizenz Erhaltung und Wartung in Nacktmaus

Das Ziel dieser Arbeit ist es, zu zeigen, wie eine hochlebensfähige Mycobacterium-Lipidsuspension hergestellt werden kann. Für in nackte Mäuse. Wir behalten das Leben des Barsches einer infizierten Maus bei, vorzugsweise in einem frühen Stadium der Infektion.

Um eine hohe Rentabilität zu gewährleisten, wird das Tier in der biologischen Sicherheitswerkbank eingeschläfert. Halten Sie den hinteren Impuls mit einer hämostatischen Pinzette. Schneiden Sie sie mit Krampfanfällen ab und tauchen Sie sie 20 Minuten lang in 2%iges Jod. Halten Sie zur Dekontamination die Punktposition mit dem Fußpolster nach oben.

Sammeln Sie das Weichgewebe Entfernen Sie mit einer Skalpellklinge die Knochen des ersten und fünften Fingergliedes, um die Homogenisierung des Gewebes zu erleichtern. Lege das Gewebe in eine sterile Petrischale. Die Epidermis abkratzen.

Schneiden Sie das granulomatöse Gewebe mit einer Schere in kleine Stücke und warten Sie auf die spätere Berechnung des Ertragsprogramms des Gewebes. Übertragen Sie die kleinen Stücke in ein Röhrchen mit einem ml Hanks ausgewogener Salzlösung. Fügen Sie einen zusätzlichen ml Stränge hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe dreimal für jeweils 15 Sekunden bei Geschwindigkeit. Vier.

Geben Sie ein Zellsieb in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Pipettieren Sie die Suspension auf das Sieb und lassen Sie die Lösung durch die Schwerkraft passieren. Um den Schmutz zu entfernen, fügen Sie der Suspension zwei weitere MLS Stränge hinzu und homogenisieren Sie sie erneut.

Führen Sie die Suspension im gleichen Zyklus durch dieses Sieb. Läutet das Sieb ein, indem es Stränge hinzufügt. Um das Gesamtvolumen der Suspension auf neun ml zu erhöhen, geben Sie einen ml 0,5%ige Tripsinlösung in die Suspension, um eine Endkonzentration von 0,05% zu erreichen.

Mischen Sie es, indem Sie das bei 37 Grad Celsius inkubierte Röhrchen 60 Minuten lang vorsichtig umdrehen. Nach der Inkubation wird das Volumen der Suspension auf vier MLS gebracht, indem eine sterile Kochsalzzentrifuge bei 1700 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius hinzugefügt wird, das Supernat verworfen und die Palette durch Klopfen auf das Röhrchen wieder aufgehängt wird. Fügen Sie einen ml Sero Kochsalzlösung hinzu und mischen Sie es.

Übertragen Sie die Suspension in ein neues Rohr. Homogenisieren Sie die vaskuläre Suspension mit einer Ein-ml-Insulinspritze mit einer 26-Gauge-Nadel, während Sie die Suspension in ein neues Röhrchen überführen. Führen Sie eine mikrobiologische Kontrolle der Suspension durch, indem Sie zwei Tropfen 18 Medium, sieben H neun Gehirn Herz Infusion geben.

11 Stein Genesen wurden bei 37 Grad Celsius inkubiert. Und befolgen Sie dann routinemäßige mikrobiologische Kontrollverfahren. Für Code-Z-Färbung.

Bereiten Sie eine Eins bis 10 und eine Eins bis Hundert vor. Verdünnung der S-Suspension in Kochsalzlösung. Homogenisieren Sie jede Verdünnung, bevor Sie diese Lichter für die Zählung vorbereiten, bereiten Sie drei Objektträger vor, indem Sie mit einem permanenten Tintenmarker drei Kreise mit einem Innendurchmesser von 10 Millimetern auf die Oberfläche jedes Objektträgers zeichnen.

Umschließen Sie nun die Kreise mit dem immunhistochemischen Stift. Beschriften Sie diese Lichter mit einem Bleistift mit der Nummer zwei, um die Lichter auf die drei Sary-Konzentrationen vorzubereiten. Unverdünnt eins zu 10 und eins zu hundert.

Fünf Mikroliter der Phenolserumlösung und 10 Mikroliter der Sary-Suspension werden in jeden Kreis pipettiert, homogenisiert und die Suspension gleichmäßig über den Bereich des Kreises verteilt. Stellen Sie diese Leuchten mit dem Griff einer Einwegschlaufe auf einen ebenen Tisch, um sie nach dem Trocknen zu trocknen. Befestigen Sie sie, indem Sie diese Lichter dreimal über die blaue Flamme führen, wobei die Junggesellenaufhängungen nach oben zeigen.

Führen Sie einen Code Zuni Sustaining durch. Sehen Sie sich diese Folien an. Die drei Verdünnungen.

Wählen Sie die am besten geeignete Verdünnung für die Sary-Zählung. Bereiten Sie 200 Mikroliter abgetötete Sary-Suspension vor, indem Sie die Gefäßsuspension 30 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren. Verwenden Sie das L 7 0 0 7 Live Dead Back Light Bacterial Viability Kit für die Fluoreszenzfärbung von mikrobakteriellen Lipiden.

Bereiten Sie eine Verdünnung von Lösung A von 10 bis 10 und eine Verdünnung von Lösung B von 10 bis 20 vor. Direkt vor dem Gebrauch. Zu je 200 Mikrolitern unverdünnter Gefäßsuspension, original und abgetötet, fügen Sie 3,6 Mikroliter der verdünnten Lösung A und sechs Mikroliter der verdünnten Lösung B hinzu. Nach 15 Minuten Inkubation im Dunkeln die Suspension bei 10.600 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius ruhig halten. Entfernen Sie das Super Natin mit der Pipette Reus.

Suspendieren Sie das Pellet in 50 Mikrolitern 10%iges Glycerin und homogenisieren Sie es, indem Sie es auf und ab pipettieren. Geben Sie acht Mikroliter jeder Suspension auf einen Glasobjektträger und decken Sie ihn mit einem kleinen Deckglas ab. Er schützt ihn vor Licht.

Suspensionen unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten. Bereiten Sie die Suspension mit einer Konzentration von 10 bis sieben BA Lippe pro ml vor, qu 1 ml Gefriermedium in jedem Kryofläschchen. Geben Sie dann 150 Mikroliter der S-Suspension zu dem einen ml des Gefriermediums und homogenisieren Sie es, indem Sie das Röhrchen umdrehen.

Stellen Sie das Kryofläschchen in den Gefrierbehälter. Halten Sie den Behälter mindestens 24 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius. Füllen Sie die Röhrchen in eine Aufbewahrungsbox und bewahren Sie sie zum Auftauen bei minus 80 Grad Celsius auf.

Tauen Sie die gefrorene Suspension in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Übertragen Sie die Suspension in ein Conico-Röhrchen mit 20 Meilen steriler Kochsalzlösung. Weigerte sich, sich zu konzentrieren.

Die Baline folgte dem Z-Erhaltungsprotokoll für die Zählung und dem Fluoreszenzfärbeprotokoll für die Bestimmung der Variabilität. Bereiten Sie die Suspension vor, die 10 bis acht BA pro Mahlzeit enthält, homogenisieren Sie die Suspension, bevor Sie jedes Tier impfen. Ziehen Sie hundert Mikroliter in eine Insulinspritze und impfen Sie 30 Mikroliter in die hinteren Fußballen jedes Tieres in der Lebensfähigkeitsbestimmung.

Die grüne Fluoreszenz wird bei allen BAI beobachtet und die rote Fluoreszenz nur bei dieser BAI. Wenn diese BAI rostfrei gesteuert werden, wird die gleiche Intensität von grünem und rotem BAI-Licht beobachtet. Die Inokulation von M Lepar, die für verschiedene Zeiträume eingefroren wurde, ergab eine 10- bis 1000-fach erhöhte Anzahl von BAI, die nach sieben Monaten wiedergefunden wurden.

Als abschließende Bemerkung möchten wir hinzufügen, dass dieses Protokoll eine schnelle und einfache Möglichkeit bietet, lebensfähiges yl Leid für weitere Anwendungen im Labor verfügbar zu halten, da IL Leid nicht in vitro wächst.