Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Lipopolysaccharid von der äußeren Oberfläche gramnegativer Bakterien zu isolieren und das Lipid eines Teils mit Hilfe von Tandem-MS-Protokollen strukturell zu charakterisieren. Dies wird durch die chemische Extraktion von Lipopolysaccharid von der bakteriellen Zelloberfläche und die anschließende milde Säurehydrolyse zur Freisetzung von Lipid A aus dem Polysaccharidteil des Lipopolysaccharids und die anschließende milde Säurehydrolyse zur Freisetzung von Lipid A aus dem Polysaccharidteil des Lipopolysaccharids erreicht. In einem zweiten Schritt wird eine Lösung von Lipid A mittels Elektrospray-Ionisations-MSMS analysiert.

In unserem Verfahren wird Lipid A entweder durch kollisionsinduzierte Dissoziation oder durch ultraviolette Photodissoziations-basierte MS zur strukturellen Charakterisierung analysiert. Die Ergebnisse zeigen Unterschiede im Fragmentierungsmuster in Massenspektren, die entweder aus kollisionsinduzierten Dissoziations- oder ultravioletten Photodissoziations-basierten MS-Protokollen erzeugt werden, bei denen UVPD ein informativeres Fragmentierungsmuster liefert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Tandem-Massenspektrometrie die Aufklärung von Zielanalyten auf der Grundlage der Interpretation diagnostischer Fragmentierungsmuster ermöglicht.

Bei ultravioletten Fotos, insbesondere bei der Dissoziation, handelt es sich um eine hochenergetische MSMS-Methode, die vielfältigere Fragmentionen erzeugt als bestehende Techniken wie die kollisionsinduzierte Dissoziation. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die verwendete UVPD-Massenspektrometrie-Methode noch nicht kommerzialisiert ist. Zusätzlich wird bei der Methode ein Laser verwendet, der vor Beginn dieses Verfahrens durch eine kundenspezifische Modifikation in ein Massenspektrometer integriert wurde.

Ernten Sie Zellen aus einer 250 mil Bakterienkultur, zentrifugieren Sie die Zellen bei 10.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Gießen Sie dann den Medienüberstand ab und waschen Sie das Zellpellet mit 50 mil eines XPBS. Nach dem Zentrifugieren zur Rep-Pelletierung gießen die Zellen den Überstand ab.

Bei der anschließenden Reanimation werden die Zellen in 40 mil eines XPBS suspendiert und auf 2 250 mil Teflon-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt. 25 mil Chloroform und 50 M Methanol werden in jedes Röhrchen gegeben, um eine einphasige Mischung zu erhalten. Durch Inversion mischen und mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Um eine vollständige Zelllyse zu gewährleisten, zentrifugieren Sie das Gemisch bei 2000 mal G für 20 Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das LPS-Pellet mit ca. 100 mil einer einphasigen Bly Dire-Mischung. 20 Minuten lang bei 2000 mal G zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Geben Sie 27 mil milden sauren Hydrolysepuffer zum LPS-Pellet und mischen Sie durch Auf- und Abpipettieren, bis nur noch kleine Partikel verbleiben, und beschallen Sie es mit einer Sondenspitze, um es homogen zu beschallen. Das LPS-Pellet wird 20 Sekunden lang bei konstanter Einschaltdauer bei 50 % Leistung in Lösung suspendiert. Wiederholen Sie die Beschallung der Probe zweimal, jeweils 20 Sekunden pro Burst und etwa fünf Sekunden zwischen den Bursts.

Anschließend kochen Sie die Proben 30 Minuten lang in einem Wasserbad. Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Wasserbad und lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen. Bevor Sie mit der Extraktion von Lipid A nach der Hydrolyse fortfahren, wandeln Sie die SDS-Lösung in ein zweiphasiges BLY-Dire-Gemisch um, indem Sie 30 mil Chloroform und 30 mil Methanol für ein Chloroform-Methanol hinzufügen, ein mildes Säurehydrolysepuffergemisch, das durch Inversion und Zentrifuge gemischt wird.

Die S-Probe 10 Minuten lang bei 2000 mal G.Mit einer Glaspipette die untere Phase in ein sauberes Teflon-Zentrifugenröhrchen extrahieren. Anschließend wird eine zweite Extraktion durchgeführt, indem 30 mil der unteren Phase aus einem voräquilibrierten zweiphasigen Bly Dire-Gemisch in die obere Phase in das durch Inversion gemischte Probenröhrchen gegeben und 10 Minuten lang 2000 mal G zentrifugiert werden. Die untere Phase mit einer Glaspipette extrahieren und den Pool mit der unteren Phase extrahieren. Zuvor.

Waschen Sie die gepoolten unteren Phasen, indem Sie 114 mil voräquilibrierte obere Phase hinzufügen, um ein zweiphasiges Bly Dire-Gemisch zu erzeugen, das durch Inversion und Zentrifuge gemischt wird. Düsen Sie 2000 mal G für 10 Minuten mit einem Glastransfer. Pipette. Die untere Phase wird in einen sauberen Glas-Rotationsverdampferkolben überführt und die Probe durch Rotationsverdampfung getrocknet.

Anschließend werden fünf mil eines Chloroform-Methanol-Gemisches in den Drehkolben gegeben und mindestens 30 Sekunden lang im Beschallungsbad badet. Zur Unterstützung der Suspension von Lipid A von den Seiten des Kolbens. Verwenden Sie eine Glastransferpipette, um das Lipid in ein sauberes Glasröhrchen zu übertragen, das mit einem mit A-P-T-F-E ausgekleideten Phenol-Schraubverschluss verschlossen ist.

Trocknen Sie die Probe unter einem Stickstoffstrahl mit einem Stickstofftrockner. Resuspendieren Sie das getrocknete Lipid in einer mil eines Chloroform-Methanol-Gemisches. Nach Zugabe des Lösungsmittels wird die Mischung verwirbelt, um eine vollständige Wiederbelebungssuspension zu gewährleisten.

In ein kleines Probenfläschchen aus Glas umfüllen und mit einem Stickstofftrockner trocknen. Lagern Sie die getrocknete Probe bis zur anschließenden DC- oder MS-Analyse bei minus 20 Grad Celsius. Die Probe kann bis zur anschließenden Analyse bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Sobald die Probe vorbereitet wurde, mischen Sie 200 Mikroliter Methanol in HPLC-Qualität mit 200 Mikrolitern Chloroform in HPLC-Qualität in einem leeren kleinen Glasprobenfläschchen, übertragen Sie 200 Mikroliter des Chloroform-Methanol-Lösungsmittelgemisches in das Fläschchen mit Lipid A und beschallen Sie den Inhalt des Fläschchens fünf Minuten lang oder bis sich das gesamte Material aufgelöst hat. Richten Sie dann das Massenspektrometer für Negativmoden-Elektron ein. Sprühionisation: Füllen Sie eine 250-Mikroliter-Spritze mit Lipid-A-Lösung.

Führen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe ein und infundieren Sie das verdünnte Lipid direkt. Eine Probe mit einer Durchflussrate von 2,0 bis 3,5 Mikrolitern pro Minute. Optimieren und verbessern Sie das Lipid-Ionen-Signal, indem Sie die Ionenoptik abstimmen.

Sammeln Sie das Massenspektrum des Lipids. Eine Spezies isoliert und aktiviert das Ziellipid A, indem sie CID als MSM-Methode auswählt. Als nächstes erhöhen Sie die CID-Spannung oder die normierte Kollisionsenergie, bis das Vorläuferlipid erreicht ist.

Eine Spezies hat eine relative Abundanz von etwa 10 % im Vergleich zur höchsten Ionenproduktion und mittelt die Spektren, bis ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist. Bereiten Sie für die Produktionen die Probe und das Massenspektrometer vor, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Schalten Sie den Laser ein, der mit dem Massenspektrometer verbunden ist.

Weitere Informationen zu MS finden Sie im Textprotokoll: Richten Sie die Gerätesoftware so ein, dass der Laser den Excimer-Laser auslöst, wenn die Ionen in die HCD-Zelle eintreten, nachdem der Pulsgenerator so eingeschaltet wird, dass der Laser alle zwei Millisekunden gepulst wird. Isolieren Sie das Lipid-A-Vorläufer-Ion, indem Sie HCD als MS MS-Methode auswählen und die Kollisionsenergie auf 1% normalisierte Kollisionsenergie einstellen. Aktivieren Sie das isolierte Lipid-Ion, indem Sie die Laserenergie erhöhen und die Anzahl der Laserpulse anpassen, die typischerweise zehn Sechs-Milli-Joule-Pulse beträgt. Erfassen Sie schließlich die Spektren und mitteln, bis ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht ist.

Für die UVPD-Produktionen. Das negative Ion MALDI TOF-Massenspektrum des Lipids A aus E Coli K 12 Stamm W 3 110 ergibt die einzelne e deprotonierte Spezies mit einem Massen-Ladungs-Verhältnis von 1796,2 als die wichtigste beobachtete Spezies. Details zur Analyse von maldi werden im Textprotokoll besprochen.

Alternativ ergibt dieselbe Lipidprobe, die einem negativen ESI-Modus unterzogen wurde, überwiegend doppelt deprotonierte Lipidionen bei einem Hauptladungsverhältnis von 898,1 ly; deprotonierte Lipidionen bei einem Hauptladungsverhältnis von 1796,20 sind beobachtbar, aber von geringerer relativer Häufigkeit zu doppelt deprotonierter Speziesfragmentierung durch CID oder 193 Nanometer. Die UVPD wurde an dem einzelnen e deprotonierten Lipidion durchgeführt. Diese Techniken können verwendet werden, um chemische Strukturen, insbesondere von Lipiden, besser zuordnen zu können.

Spezies, die komplexe Kombinationen von Modifikationen oder bisher nicht charakterisierte chemische Modifikationen enthält. Fragmentierungsprofile werden mit gestrichelten Linien dargestellt, die Spaltstellen darstellen, und werden mit den Werten des Hauptladungsverhältnisses unter jeder bereitgestellten Struktur abgeglichen. Die in roter Schrift hervorgehobenen Werte des Master-Charge-Verhältnisses und der Spaltstellen stellen einzigartige Produktionen dar, die mit UVPD 32 P-markiertem Lipid assoziiert sind.

Ein aus zwei verschiedenen E-Coli K 12-Stämmen isolierter Stämme wurde mittels TLC analysiert. Das Protokoll für dieses Verfahren ist im Textprotokoll ausführlich beschrieben. Der K 12-Stamm W 3 110 enthält überwiegend BIS- und Tris-phosphoryliertes Lipid A oder ist ein komplexeres DC-Muster wird bei 32 p-Lipid beobachtet.

Ein isoliertes aus dem E-Coli-Stamm WD 1 0 1. WD 1 0 1 produziert Lipid. Ein stark modifiziertes mit Rabino und Phosphoethanolamin.

Da sowohl ein als auch vier Primephosphate für die Modifikation zur Verfügung stehen, kann das Lipid A aus WD 1 0 1 als einfach modifiziert beschrieben werden, das nur eine el-Aminoarabinose oder Phosphoethanolamin entweder als Phosphat enthält, oder als doppelt modifiziert, wobei beide Phosphate kombinatorisch modifiziert sind. Neben der Modifikation an den Ein- und Vier-Prime-Phosphaten wird auch die Palmitat-Edition beobachtet und erhöht den RF-Wert der Lipid-A-Spezies in diesem Lösungsmittelsystem. Dieses Protokoll hat Forschern auf dem Gebiet der Mikrobiologie den Weg geebnet, um die Beziehungen zwischen Struktur und Funktion in Bezug auf die Auswirkungen von Lipid-a-Modifikationen auf die Biologie gramnegativer Bakterien weiter zu untersuchen.

Wir sind auch sehr interessiert und haben die Leistungsfähigkeit der UVPD-basierten MS zur Charakterisierung der Strukturen biologisch wichtiger Moleküle wie Glykane, Proteine, Nukleinsäuren und anderer komplexer Lipide demonstriert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit organischen Lösungsmitteln, biologisch gefährlichen Materialien und Lasern äußerst gefährlich sein kann. Es ist wichtig zu betonen, dass Lösungsmittel in belüfteten chemischen Abzügen gehandhabt werden sollten.

Geeignete Schutzausrüstung wie Handschuhe und Schutzbrille sollten immer getragen werden und der für UVPD verwendete Laser sollte ordnungsgemäß abgeschirmt sein.