Polyäpfelsäure-basierten Nano Biopolymere für Targeting mehrerer Tumormarker: Eine Chance für die personalisierte Medizin?

Das übergeordnete Ziel ist es, eine nanoskalige Plattform zu etablieren, die für ein universelles Protokoll zur Synthese personalisierter Medizin auf der Grundlage des genetischen Outfits der Krankheit einer Person, insbesondere bei Krebs, offen ist. Zuerst wird Polyäpfelsäure aus dem Mikroorganismus frum polycephalum hergestellt und gereinigt, um das gereinigte PMLA an seinem Anhänger chemisch zu aktivieren. Carbonylische Gruppen binden die kleinen funktionellen Gruppen und den Linker MEA durch Substitution der aktivierten Gruppen und führen die ungenutzten aktivierten Gruppen durch Hydrolyse in Carboxylgruppen zurück.

Als nächstes fügen Sie die Antikörper und Antisense-Moleküle über die Sulfhydrogruppen des Spacers, MEA und der Kappe hinzu. Der unbenutzte Abstandhalter wird durch Reaktion mit PDP nach Fertigstellung auf die Zusammensetzung und die Funktion der Leitung geprüft. Das Nano-Medikament resultiert aus einem Tiermodell wie Mäusen, die einen aggressiven Menschen tragen.

IHR zwei positiver Brustkrebs kann über die Wirksamkeit der Behandlung entscheiden und auch darüber, ob die Behandlung ohne unerwünschte Nebenwirkungen verläuft. Der Hauptvorteil der Bioproduktion gegenüber bestehenden synthetischen Methoden wie der Oping-Polymerisation besteht darin, dass das Biopolymer seine volle optische Reinheit behält und nicht mit Nebenprodukten verunreinigt wird. Diese Familie von PolyPhen-Nanomedikamenten kann auf jeden Zelltyp abzielen, basierend auf spezifischem Targeting, und die Proteinexpression regulieren.

Im Allgemeinen ist die Krebsbehandlung mit PHE-Nanomedikamenten in mehreren Tiermodellen sehr effizient, wobei primäre Hirn- und Brustkrebserkrankungen aufgespießt werden. Wir hatten zunächst die Idee für diese Methode, um die Synthese von Glioblastom-spezifischem Laming in isof-Formen zu blockieren und später haben wir die gezielte Hemmung der HER zwei und dreifach negativen Brustkrebsproteine zur Verhinderung des Tumorwachstums nachgewiesen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose von Krebs mit Hilfe von optischer und magnetischer Resonanztomographie.

Poly-Nano-Medikamente können Einblicke in die Verabreichung von Medikamenten für die Krebsbehandlung geben. Es kann auch auf andere pathologische Zustände wie Infektionskrankheiten, Schmerzlinderung und neurologische Störungen angewendet werden. Nachdem Sie eine Samen-Plasmodium-Kultur aus Spial auf Schnecke gezüchtet haben, inokulieren Sie 100 Milliliter Basalkulturmedium und züchten Sie die Kultur bei 25 Grad Celsius.

Der Inkubator der Thermoskanne erzeugt eine Menge an schwerkraftgepackten Mikroplasma-Modika unter Ausschluss von Licht. Um Sporulation in einem 10-Liter-Bioreaktorgefäß zu vermeiden, lösen Sie 80 Gramm Calciumcarbonat in acht Litern Basalmedium, übertragen Sie dann das Pact-Mikroplasma-Modia in das montierte Reaktionsgefäß und stellen Sie den Bioprozess auf 75 Stunden ein. Bei 25 Grad Celsius bei einem Durchfluss von 10 Litern pro Minute gefilterter Luft und 150 U/min Rühren durch ein Segmentrührwerk.

Wenn die Kulturbrühe einen pH-Wert von 4,8 hat, stoppen Sie die Kultur, um die Produktion von Polymaleinsäure zu messen. Kühlen Sie nun die Brühe auf 17 Grad Celsius ab und lassen Sie die Zellen durch die Schwerkraft absetzen und entfernen Sie den Kulturüberstand aus dem Reaktor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein.

Pumpen Sie nun den Überstand von unten durch eine 1,5 Liter fassende DEAE-Zellulosesäule, die mit 20 Millimolar Trishydrochlorid, pH 7,5, bei fünf Grad Celsius äquilibriert ist. Führen Sie dann drei Säulen mit Waschpuffer mit 0,3 molaren Natriumchlorid von der Unterseite zur Oberseite der Säule durch und eluieren Sie das PMLA in Gegenwart von 0,7 molaren Natriumchlorid. Stellen Sie die PMLA-umgangene Fraktion auf 0,1 molare Calciumchlorid ein und fügen Sie 80 % eiskaltes Ethanol hinzu, um das PMLA-Calciumfraktionat der nächsten Größe, das PMLA-Calcium mit Cidex G 25 und Wasser auszufällen.

Zum Schluss wird jede Fraktion über eine bernsteinfarbene Lichtsäule geleitet und der Durchfluss sofort durch Polyäpfelsäure in flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophilisiert, bevor er bei minus 20 Grad Celsius gelagert wird. Um die Carboxylgruppen von PMLA zu aktivieren, mischen Sie eine Millimol-Mala-Einheit P-M-L-A-H in einen Milliliter wasserfreies Aceton und je ein Millimol aus einem Hydroxy-CIN-Aide und Cylo-Heylcarbo-Id in zwei Millilitern Dimethylformamid nach dreistündigem Rühren bei 20 Grad Celsius und fügen Sie 0,05 zu. Millimol Methyl Pega bedeuten in einem Milliliter DMF, gefolgt von 0,05 Millimol Triethylamin.

Fügen Sie dann tropfenweise 0,4 Millimol Leucinethylester hinzu und prüfen Sie nach einer Stunde auf den Abschluss der Reaktion durch negative Hyn-Reaktion in der Dünnschichtchromatographie. Fügen Sie auf ähnliche Weise 0,1 Millimol von zwei Me-Capto, einem Ethylamin und 0,5 Millimol TEA hinzu. Entfernen Sie den übrig gebliebenen NHS-Ester durch spontane Hydrolyse mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.

Entsalzen Sie es über eine PD 10-Säule und lyophilisieren Sie, um ein weißes Pulver zu erhalten, lagern Sie dieses Vorkonjugat trocken bei minus 20 Grad Celsius. Fügen Sie als nächstes 30 Milligramm Antikörper in 4,5 Millilitern 150 Millimolar Natriumchlorid in 100 Millimolar Natriumphosphat bei pH 5,5 hinzu. Reduzieren Sie die Diss-Sulfidbindungen mit fünf millimolaren Tris, zwei Carboxyethylphosphinhydrochlorid und reinigen Sie über eine PD 10-Säule.

Lösen Sie nun die IDE PEG IDE in zwei Millilitern des oben genannten Puffers auf, allerdings bei pH 6,3. Den reduzierten Antikörper zugeben und eine Stunde bei 20 Grad Celsius rühren. Auf 2,5 Milliliter über AVEVA Spin 20 mit 30 Kilodalton Ausschluss konzentrieren und anschließend über Cidex G 75 reinigen.

Verifizieren Sie nun das Produkt über SEC HPLC. Messen Sie die Menge bei 280 Nanometern und bestätigen Sie auch bei anderen Wellenlängen das Fehlen von Verunreinigungen. Mischen Sie anschließend 50 Milligramm des Präkonjugats mit 200 MLEs des Antikörper-konjugierten PEG IDE in fünf Millilitern des pH-Puffers von 6,3.

Die Konzentration von Sulf Hydro wird auf zwei Millimolare eingestellt und drei Stunden lang bei 20 Grad Celsius inkubiert. Um eine Solubilisierung mit einer Ausbeute von 98 % zu erhalten, reagieren die drei Prime-Amino-Antisense-Oligonukleotide mit einem Volumen SPDP, reinigen das A-O-N-P-D-P über Cidex LH 20 in Methanol, verdampfen dann das Methanol, lösen das Produkt in Wasser auf und lyophilisieren inkubieren nun 800 Nan-Tiere des aktivierten AOS mit dem Antikörper PEG prekonjugieren zu MEA SH über Nacht. Wenn die Diss-Sulfid-Austauschreaktion beendet ist, wird der Fluoreszenzfarbstoffblock und die überschüssigen Sulfhydros mit PDP eingebaut und über Cidex G 75 gereinigt.

Lagern Sie das endgültige Nanomedikament auf Polyapfelsäurebasis bei minus 20 Grad Celsius, um den Gehalt an Polymaleinsäure während der Produktion abzuschätzen, gehen Sie wie folgt vor: Zu 320 Mikrolitern Probe werden 160 Mikroliter 10 % Hydroxylammoniumchlorid und 160 Mikroliter 10 % Natriumhydroxid hinzugefügt. Nach 10 bis 15 Minuten mit 160 Mikrolitern 5%iger Eisenchloridlösung mischen und die Bildung einer dunkelvioletten Farbe bei 540 Nanometern visualisieren. Als nächstes hydrolysieren Sie das Nanomedikament über Nacht in zweimolarer Salzsäure bei 110 Grad Celsius unter Verwendung eines versiegelten Ampullenassays für Maleininsäure durch umgekehrte Phasenchromatographie.

Verwendung von Proben, die mit Maleinsäurestandards versetzt sind. Spalten Sie nun das Nano-Medikament mit 100 millimolaren Dihi drei Etol-Molekülen und messen Sie die Morph-Antisense-Oligonukleotide durch quantitative Umkehrphasen-HPLC gegen Morpho- und ON-Standards. Messen Sie mit dem gespaltenen Nanomedikament den Antikörpergehalt mit einem Proteinassay-Kit, um den Malik-PEG-Gehalt zu quantifizieren.

Zuerst mit Ammonium-OT-Thiocyanat reagieren, dann mit Chloroform extrahieren und die Absorption bei 510 Nanometern messen. Testen Sie die Antikörperaktivität und -ligation durch Eliza mit fünf Mikrolitern Nanomedikament pro Vertiefung und 0,5 Mikrogramm pro Vertiefung ihrer beiden plattenbeschichteten Antigene. Berechnen Sie abschließend den erreichten Prozentsatz für das Antisense-Oligonukleotid EG. Und Antikörper in Bezug auf Maleinsäure.

Vergleichen Sie mit dem Prozentsatz, der durch das Arzneimitteldesign beabsichtigt ist. Dieser bimodale strategische Ansatz für das Nanomedikament nutzt Herceptin, um den HER-Signalweg zu hemmen, und HER zwei spezifische a ON, um die Transkription der HER-Antikörper zu blockieren; zwei Rezeptor-Antikörper erleichtern die Transzytose über endotheliale TFR des Tumorgefäßes. Die Nanokonjugatplattform Polymaleinsäure wurde durch kultiviertes Mikroplasmo hergestellt und gereinigt, wobei die Aktivierung der PMLA-Carboxylgruppen die Synthese des präkonjugierten Gerüsts erleichterte.

Und schließlich das Blei-Nano-Konjugat. Die Eli SA-Assays zeigten die Beibehaltung aktiver monoklonaler Antikörper während der gesamten Nano-Wirkstoffsynthese. Da beide Antikörper auf derselben Polymerplattform angeordnet waren, verfolgte die konfokale Fluoreszenzmikroskopie die zelluläre Aufnahme des Nanomedikaments.

Die überlagerten Bilder bei null und drei Stunden wurden zusammen mit den markierten Endosomen analysiert. Die Korrelationskoeffizienten von Pearson für die Kolokalisation deuten auf die Freisetzung von Nano-Wirkstoffen von Endosomen in das Zytoplasma und die Dissoziation eines ON vom Nano-Wirkstoff durch eine Glutathion-abhängige Diss-Sulfid-Spaltung im Zytoplasma hin. In vitro hemmte das Lead-Nano-Medikament das Wachstum in der HER zwei überexprimierenden Zelllinie signifikant am effektivsten.

In-vivo-Experimente an Mäusen, die BT 4 74 und HER trugen, zeigten eine Wachstumshemmung von mehr als 95 % durch das Blei-Nano-Medikament, das Herceptin enthält. Und HER zwei spezifische A ON ex vivo Western Blotting zeigten eine Hemmung sowohl der HER 2-Synthese als auch die Phosphorylierung einer KT-Spaltung der PARP-markierten Apoptose. Die Tumorregression als Reaktion auf eine medikamentöse Behandlung wird durch histologische Untersuchung durch Schrumpfung des Tumors und Depletion der Tumorzellen nachgewiesen.

Sie sollten jetzt ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine biokompatible Nanoplattform verwenden können, um eine wirksame personalisierte Behandlung ohne Nebenwirkungen zu erreichen und ein Nanomedikament mit einer Kontrollzusammensetzung und verifizierten funktionellen Aktivitäten zu erreichen Sobald diese Sensoren beherrscht sind, können sie nach ihrer Entwicklung mit hoher Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Diese Technik, die eine Polysäure-Nanoplattform für die gezielte Verabreichung von Antisense-Oligonukleotiden verwendet, ebnet Forschern auf dem Gebiet der personalisierten Ano-Medizin den Weg, um die Tumorbehandlung zu erforschen, die auf spezifische molekulare Tumormärkte abzielt, die durch personalisierte genetische Analysen identifiziert wurden. Pharmakologisch können Wirkstoffe und Zellen äußerst gefährlich sein.

Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Maske und Handschuhen sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.