Ein schnelles Protokoll zur Integration extrachromosomaler Arrays mit hoher Übertragungsrate in das Genom von C. elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, transgene extrachromosomale Arrays mittels ultravioletter Bestrahlung in das Serratus-Elegance-Genom zu integrieren. Zuerst wählen Sie die transgene Linie mit der höchstmöglichen Transmissionsrate, idealerweise mehr als 80 %, dann UV-Bestrahlung der ausgewählten transgenen L vier Larven und wählen Sie vier der fluoreszierenden transgenen F zwei Tiere aus jeder ausgewählten F1-Platte aus. Nächster Bildschirm, die F zwei Platten für 100% fluoreszierend transgen.

F drei Würmer. Letztendlich kann die Auswahl eines fluoreszierenden Tieres der dritten Generation die 100%ige Vererbung des Transgens zeigen. Dieser experimentelle Ansatz eignet sich gut für transgene Linien, die zusätzliche Chromosomenarrays mit hoher Geschwindigkeit übertragen.

Das Verfahren wird von Stephanie Belman, einer Technikerin aus unserem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie mit 500 großen Petrischalen mit Nematodenwachstum. Medium Säen Sie jede Platte mit 0,3 Millilitern gesättigten isia coli aus.

OP 50 Kultur. Bewerten Sie die Transmissionsrate der zu integrierenden transgenen Linie für jede transgene Linie. Nehmen Sie 10 fluoreszierende Erwachsene mit Gravitation auf 10 separate Kulturplatten unter einer fluoreszierenden Stereoskopkultur.

Die Tiere werden in einem Wurmbrutkasten auf eine Temperatur eingestellt, die für die Reproduktion des genetischen Hintergrunds freizügig ist. Überwachen Sie die Nachkommen jeden Tag, um zu beurteilen, in welchem Entwicklungsstadium der Co-Injektionsmarker exprimiert wird und am besten mit Fluoreszenzoskopie beobachtet werden kann. Bewerten Sie die Übertragungsrate der Nachkommen, indem Sie den Prozentsatz der fluoreszierenden Nachkommen bestimmen.

Wählen Sie für die transgene Integration die transgene Linie mit der höchsten Übertragungsrate aus. Es wird eine Population transgener Tiere erhalten, die im L-Vierlarvenstadium synchronisiert sind. Für die Integration werden 30 fluoreszierende adulte GRA-Zellen auf fünf Kulturplatten gepickt.

Nachdem die Würmer drei bis vier Stunden lang bei 15 Grad Celsius Eier gelegt haben, prüfen Sie, ob mindestens 30 Eier pro Platte vorhanden sind, und entfernen Sie dann die erwachsenen Tiere von den Platten. Kulturieren Sie die Tiere in einem Wurmbrutkasten, bis die Nachkommen das Larvenstadium L vier erreichen. Jede Platte mit 15 bis 20 fluoreszierenden transgenen L vier Tieren wird bei abgenommenen Deckeln in einen UV-Vernetzer gelegt und die Würmer zur Gewinnung bestrahlt. Inkubieren Sie die bestrahlten Würmer über Nacht bei 15 Grad Celsius.

Überprüfen Sie, wie viele Tiere in unseren Händen leben. Eine Überlebensrate von etwa 80 bis 90% ist für eine effiziente Bestrahlung geeignet. Züchten Sie die bestrahlten Tiere bei 15 bis 25 Grad Celsius, bis die Nachkommen das Entwicklungsstadium erreicht haben, was die Beobachtung der Co-Injektionsmarker-Expression ermöglicht.

Übertragen Sie einzelne fluoreszierende F1-Tiere auf separate Kulturplatten. Halten Sie diese F1-Platten bei 15 bis 25 Grad Celsius, bis die Nachkommen je nach verwendetem Co-Marker ein geeignetes Stadium für die Beobachtung von fluoreszierenden F-Zwei-Tieren erreicht haben. In diesem speziellen Fall beobachteten wir, dass die Würmer als Erwachsene alle F1-Platten verwarfen, die entweder eine, keine Nachkommenschaft zeigten, was darauf hindeutete, dass das F1-Tier steril war oder starb, oder zwei keine oder nur wenige fluoreszierende F-Zwei-Tiere, was darauf hindeutet, dass das F1-Tier das Transgen nicht mit der erwarteten Rate übertrug.

Wählt vier fluoreszierende transgene F zwei Tiere aus jeder ausgewählten F1-Platte aus. Bei der Verwendung von fluoreszierenden Transgenen wählen Sie F zwei Würmer mit einem hohen Fluoreszenzgrad, da dies darauf hindeuten könnte, dass diese Tiere homozygot für das integrierte Array sind. Beachten Sie, dass es bei der Auswahl von zwei Tieren wichtig ist, keine Eier oder Larven mit sich zu führen, um falsch negative Ergebnisse im nächsten Schritt zu vermeiden.

Nach dem Züchten der F zwei Tiere screenen Sie die F zwei Platten auf 100% fluoreszierende transgene F drei Würmer. Das Screening erfolgt recht schnell, da das Vorhandensein eines einzigen nicht fluoreszierenden Wurms darauf hinweist, dass die Platte weggeworfen werden sollte, wählen Sie acht fluoreszierende F-3-Tiere aus ausgewählten Platten aus, um die 100%ige Vererbung des Transgens zu bestätigen. Wenn möglich, sollten mehrere unabhängige integrierte transgene Stämme beibehalten werden.

Es wurden Integrationen von Transgenen in zwei verschiedenen Linien durchgeführt, die zusätzliche chromosomale Arrays mit etwa der gleichen Frequenz übertragen. Unter Verwendung des Standards und der verbesserten Protokolle werden die Zeit und die Anzahl der pro integrierter Linie erforderlichen Platten im verbesserten Protokoll optimiert. Als nächstes testeten wir die Hypothese, dass eine höhere Transgen-Übertragungsrate in einer nicht-integrierten Linie die Integration des Transgens in das Genom erleichtert.

Ein bestimmtes Transgen wurde in Linien integriert, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten senden, wobei das verbesserte Protokoll für die höchste Sendeleitung verwendet wurde. Drei integrierte Linien wurden von nur 90 ausgewählten F1-Tieren gewonnen, während für die transgene Linie, die zu 50 bis 60 % übertragen wurde, eine integrierte Linie von 110 ausgewählten F1-Tieren gewonnen wurde. Im Anschluss an dieses Verfahren können verschiedene Methoden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Bestimmung der Genexpression, des Musters und der Regulation, der Proteinlokalisierung und Proteinüberexpression oder die Entwicklung subzellulärer Marker.