Analyse von Skelettmuskeldefekten bei Zebrafischlarven mittels Doppelbrechung und berührungsempfindlichen Escape-Response-Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Ausmaß der myofibrillären Organisation in durchscheinenden Zebrafischlarven zu bewerten und ihre Schwimmstrecke als Reaktion auf die taktile Stimulation für beide Methoden zu quantifizieren. Dies wird zunächst durch die Paarung des Zebrafisches und dann durch das Sammeln lebensfähiger Eier im zweiten Schritt des Assays zur Beurteilung der Muskelstruktur erreicht. Ein beschichteter anästhesierter Zebrafischembryo wird direkt zwischen zwei polarisierten Linsen auf einem Stereomikroskoptisch positioniert, so dass der Fisch entlang der Seitenachse seines Körpers ausgerichtet ist und sich in einer möglichst flachen Ausrichtung befindet.

Die Doppelbrechung wird dann visualisiert und die Muskelintegrität quantifiziert. Im zweiten Schritt des berührungsevozierten Escape-Assays wird eine einzelne beschichtete Larve in eine tiefe Petrischale gelegt und dann im Sichtfeld des Stereomikroskops zentriert. Ein meno-sensorischer Reiz wird an die Larven abgegeben, indem der Schwanz mit einer Insektennadel berührt wird, und die Reaktion des Tieres wird abgebildet, bis der Embryo aufhört zu schwimmen oder aus dem Sichtfeld schwimmt.

Letztendlich können Unterschiede in der Muskelorganisation und den Reaktionen des Bewegungsapparates quantifiziert werden. Die Hauptvorteile dieser nicht-invasiven Techniken bestehen darin, dass eine große Anzahl von Fischen schnell analysiert werden kann und Skelettmuskeldefekte bei ein und demselben Fisch über mehrere Tage in vivo überwacht werden können. Visuelle Demonstrationen des Aufstellens von polarisierten Gläsern und des Positionierens der Larven in der richtigen Ausrichtung sind entscheidend für den Erfolg.

Mit diesen Assays reinigen Sie die unbrauchbaren Eier aus allen Gelegen, die von sich paarenden erwachsenen Fischen gesammelt wurden. Diese erscheinen in der Regel mit bloßem Auge weiß und undurchsichtig oder als eine Ansammlung dunkler, unorganisierter Zellen unter dem Mikroskop und bringen die Embryonen drei bis sieben Tage nach der Befruchtung für das weitere Wachstum in den Inkubator zurück. Wenn der Embryo von Interesse in seinem Kern verbleibt, verwenden Sie eine scharfe Pinzette, um vorsichtig einen Riss in den Kern des interessierenden Embryos zu machen, und drehen Sie ihn dann auf den Kopf, so dass der Embryo herausfällt.

Betäuben Sie die beschichteten Embryonen mit Trica, um ihre korrekte Positionierung zu unterstützen, und setzen Sie dann ein Präpariermikroskop mit einer polarisierten Linse ein, die gedreht werden kann, um den Winkel des polarisierten Lichts einzustellen. Sobald sich die Embryonen begradigt haben, positionieren Sie eine zweite polarisierte Linse auf dem Mikroskoptisch direkt unter der oberen Linse und platzieren Sie die Embryonen direkt auf der zweiten Linse. Jeder Embryo von Interesse sollte dann entlang der Seitenachse seines Körpers positioniert werden.

Drehen Sie die obere Linse mit dem interessierenden Embryo im Blickfeld, bis die Polarisationsachse der beiden Linsen um 90 Grad voneinander ausgerichtet ist und der Hintergrund vollständig dunkel ist. Bewegen Sie den Fisch herum, um sicherzustellen, dass er so flach wie möglich liegt. Wenn ein Fisch gekrümmt ist, lassen nur die Segmente mit einer flachen Ausrichtung das polarisierte Licht durch und stellen sich frt aus.

Beobachten Sie nun den bi frt-Phänotyp des Wildtyp-Fisches. Hoch organisierte Skelettmuskeln zeigen sich hell um frt, da der Brechungsindex für das Licht parallel zu den Myofilamenten höher ist als das polarisierte Licht senkrecht zu diesen Strukturen. Fische mit disorganisierter Skelettmuskulatur, die auf eine neurodegenerative Myopathie oder einen Entwicklungsdefekt hindeuten, zeigen typischerweise eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechungsrate bei Fischen mit disorganisierter Skelettmuskulatur.

Charakteristisch für Muskeldystrophie. Sie weisen häufig ein fleckenartiges Muster der Doppelbrechung auf, wobei dunkle Bereiche eine Muskeldegeneration zwischen hellen Bereichen normaler Muskelarchitektur darstellen. Sammeln Sie Bilder des Fisches unter polarisiertem Licht zur Quantifizierung der Doppelbrechung.

Speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien. Öffnen Sie die Doppelbrechungsbilder in einer Bildverarbeitungssoftware. Wenn Sie Bild J wie hier gezeigt für jedes Bild verwenden, verwenden Sie zunächst das Polygonauswahlwerkzeug, um eine Linie um den Körper des Fisches zu ziehen, um die Fläche des Zebrafischmuskels für die Messung festzulegen.

Wählen Sie dann im Dropdown-Menü "Analysieren" die Option "Messungen festlegen" aus, um die erforderlichen Statistiken für das Bild auszuwählen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für den mittleren Grauwert der Fläche sowie den minimalen und maximalen Grauwert, um den Assay für das berührungsprovozierte Fluchtverhalten zwei bis sieben Tage nach der Befruchtung einzurichten. Platzieren Sie die beschichteten Fische einzeln in tiefe Petrischalen und arbeiten Sie jeweils nur mit einem Embryo.

Zentrieren Sie den Fisch im Sichtfeld eines Stereomikroskops, das mit einem digitalen Kamerasystem ausgestattet ist, und beginnen Sie die sequenzielle Bildgebung mit Bildraten von mindestens 30 Hertz. Berühren Sie dann mit einer Insektennadel den Schwanz des Embryos, um den Meno-Sinnesreiz abzugeben, und stoppen Sie die Bildgebung, wenn der Embryo aufgehört hat zu schwimmen oder aus dem Sichtfeld geschwommen ist. Konvertieren Sie abschließend die sequenziellen Bilder in eine Videodatei oder analysieren Sie die einzelnen Frames von Zeitrafferbildern.

Die Offline-Doppelbrechung kann als effizienter nicht-invasiver Assay verwendet werden, um Licht auf den Zustand der Myofibrillärorganisation in lebenden Zebrafischembryonen zu werfen, Wildtyp-Zebrafische zeigen fünf Tage nach der Befruchtung aufgrund ihrer geordneten Anordnung von Myofilamenten unter polarisiertem Licht stark frt Skelettmuskeln. Im Gegensatz dazu zeigen altersangepasste Embryonen, die homozygot für eine pathogene Mutation im Distro-Glykan- oder DAG-Eins-Gen sind, eine lückenhafte Doppelbrechung, die auf Bereiche der Muskeldegeneration hinweist. Dieses fleckenartige Muster und das schnelle Fortschreiten der Muskeldegeneration während der frühen Entwicklung stimmt mit anderen dystrophischen Fischmodellen überein.

Bei der Quantifizierung der Doppelbrechung fünf Tage nach der Befruchtung zeigten dystrophische DAG-1-Mutanten eine signifikante Verringerung der Helligkeit auf 27,9 plus oder minus 5,3% der maximalen Doppelbrechung, die bei ihren Wildtyp-Geschwistern beobachtet wurde. Diese Reduktion ist schwerwiegender als die Reduktion auf 52,4 plus oder minus 5,5 %, die drei Tage nach der Befruchtung beobachtet wurde myopathische mtm one morphine myopathisch Fischmodelle zeigen stattdessen tendenziell eine allgemeine Verringerung der Doppelbrechung im Vergleich zum Wildtyp, da es häufig zu einer myofibrillären Desorganisation in den wichtigsten axialen Skelettmuskeln kommt, aber keine Hinweise auf degenerative Veränderungen. Empfindliches, fokussiertes Fluchtverhalten kann verwendet werden, um zu zeigen, dass Zebrafischmodelle für Skelettmuskelerkrankungen Bewegungsstörungen und Schwimmschwierigkeiten aufweisen.

Dieses erste Video zeigt einen Test des berührungsevozierten Fluchtverhaltens an Wildtyp-Zebrafischen. Beachten Sie, dass die normalen Jungfische fünf Tage nach der Befruchtung sehr schnell wegschwimmen. Als Reaktion auf die Berührung in diesem zweiten Video, dag eine Jungfische, wurde die Berührung evoziertes Fluchtverhalten erfasst.

Beachten Sie, dass mutierte Embryonen am fünften Tag nach der Befruchtung eine beeinträchtigte Reaktion auf Berührung zeigen und das Sichtfeld nach der Stimulation nicht verlassen. Die Videos wurden dann Bild für Bild analysiert, um zu bestätigen, dass DAG-1-Mutanten im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen eine beeinträchtigte Bewegung als Reaktion auf taktile Reize aufweisen. Die Entfernungen, die beide Embryonentypen innerhalb eines festgelegten Zeitintervalls zurücklegen konnten, wurden gemittelt und deuten auf eine verminderte motorische Funktion bei DAG-1-Mutanten hin.

Wenn diese Techniken einmal beherrscht sind, können sie über einen kurzen Zeitraum an großen Mengen von Fischen durchgeführt werden, was bei der Durchführung von chemischen oder Mutagenese-Screenings mit hohem Durchsatz von entscheidender Bedeutung ist. Im Anschluss an dieses Verfahren können invasivere Ansätze wie Immunhistochemie oder Elektronenmikroskopie durchgeführt werden, um Defekte im Skelettmuskel auf molekularer und struktureller Ebene zu untersuchen.