PLGA-Nanopartikel durch Einzel-oder Doppel-Emulsion mit Vitamin E-TPGS gegründet

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Polymer-Nanopartikel von einstellbarer Größe zu bilden. Dies wird erreicht, indem zunächst das Polymer in einem organischen Lösungsmittel aufgelöst und ein Arzneimittel oder ein fluoreszierendes Verkapselungsmittel hinzugefügt wird. Der zweite Schritt besteht darin, das Polymer mit einer Wasserphase zu emulgieren, die das Emulgator enthält, und dann die Partikel in einem größeren wässrigen Volumen aushärten zu lassen, während das Lösungsmittel verdampft.

Anschließend werden die Partikel gewaschen, durch Zentrifugation aufgefangen und für die Langzeitlagerung lyophilisiert. Der letzte Schritt besteht darin, die Größe und Oberflächenmorphologie der Nanopartikel mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie oder der REM-Bildgebung zu charakterisieren. Letztendlich wird das REM verwendet, um zu zeigen, dass die Größe von Nanopartikeln durch Variation der Emulgatorkonzentration kontrolliert werden kann.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, da Partikel so angepasst werden können, dass sie eine breite Palette von Therapeutika verkapseln und für eine nachhaltige Wirkung abgeben. Im Zielgewebe. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung.

Die Emulgierschritte sind schwer zu erlernen, da subtile Aspekte der Bildung der Emulsion einen erheblichen Einfluss auf die Eigenschaften der Partikel haben können. Um mit der Vorbereitung der Nanopartikel zu beginnen, geben Sie etwa 100 Milligramm polymilchige Co-Glykolsäure, auch bekannt als PLGA, in ein 13 x 100 Millimeter großes Reagenzglas. Übertragen Sie dann mit einer serologischen Glaspipette einen Milliliter Ethylacetat auf die Probe, bedecken Sie die Oberseite des Röhrchens mit der Aluminiumfolie und filmen Sie die Folie dann sicher.

Achten Sie darauf, den Parameter fest über die Oberkante des Fläschchens und die Unterkante der Folie zu wickeln, um ein Verdampfen des Lösungsmittels zu verhindern. Markieren Sie den Füllstand des Lösungsmittels auf dem Reagenzglas und lassen Sie das Polymer über Nacht auflösen. Fügen Sie am nächsten Tag zusätzliches Lösungsmittel hinzu, falls eine Verdunstung auftritt.

Bereiten Sie die folgenden Geräte und Materialien in einem Abzug in der Nähe des Ultraschalls vor. Ein Wirbel: zwei kleine Weidepipetten aus Glas mit Gummikugeln und einer magnetischen Rührplatte. Stellen Sie zusätzlich einen großen Becher mit Eiswasser auf einen Ständer unterhalb des Ultraschalls.

Geben Sie anschließend 45 Milliliter mit 0,3 % Gewicht pro Volumen, Vitamin E-T-P-G-S in einen 200-Milliliter-Glaslautsprecher und stellen Sie dann die Rührgeschwindigkeit auf 360 U/min ein. Geben Sie dann zwei Milliliter des 0,3 % Gewichtsprozent pro Volumen, Vitamin E-T-P-G-S in ein 13 x 100 Millimeter großes Reagenzglas aus Glas. Um hydrophobe Mittel einzumischen, fügen Sie das Verkapselungsmittel direkt zur Polymerlösung hinzu, wobei Sie darauf achten müssen, die Wände des Reagenzglases zu vermeiden und das Röhrchen zu wirbeln, bis das Verkapselungsmittel homogen dispergiert ist.

Bei hydrophilen Mitteln emulgiert man das Vergussmittel mit der Polymerlösung. Geben Sie bis zu 50 Mikroliter des Arzneimittels in Puffer auf die Oberfläche der Polymerlösung. Ultraschall der Mischung auf Eis für ca. 10 Sekunden oder bis die Lösung undurchsichtig und homogen ist.

Drehen Sie dann das Reagenzglas mit Vitamin E-T-P-G-S auf hoher Stufe, während Sie das Reagenzglas senkrecht halten. Halten Sie die Glaspipette ein bis zwei Zentimeter über der Oberseite des Vortex-Rohrs und geben Sie die Polymerlösung langsam tropfenweise auf die Oberfläche des Vortexing-Ul. Achten Sie darauf, dass die Pipette die Seiten des Röhrchens nicht berührt, nachdem die gesamte Polymerlösung hinzugefügt wurde.

Fahren Sie mit dem Vortexen der Lösung fort. Nun eine Emulsion für 15 Sekunden. Übertragen Sie das emulgierte Polymer sofort auf den Ultraschallator.

Lassen Sie das Reagenzglas in Eiswasser getaucht und beschallen Sie die Emulsion in drei Zehn-Sekunden-Stößen. Bewegen Sie die Emulsion in der Sonde auf und ab, um eine gleichmäßige Beschallung zu gewährleisten und zu vermeiden, dass die Sonde an den Seiten oder am Boden des Reagenzglases berührt wird. Pausieren Sie zwischen jeder zehnsekündigen Beschallung fünf bis 10 Sekunden, damit die Lösung abkühlen kann, bevor Sie fortfahren.

Geben Sie dann ein bis zwei Milliliter 0,3%VITAMIN E-T-P-G-S aus der Rührlösung in die Emulsion. Dadurch wird das emulgierte Polymer verdünnt, wodurch es leichter gegossen werden kann, und die Emulsion in die Rührlösung entleert. Waschen Sie die restliche Lösung aus dem Reagenzglas in die Rührlösung aus.

Lassen Sie die Nanopartikel unter Rühren drei Stunden lang aushärten. Wenn das Verkapselungsmittel lichtempfindlich ist, wickeln Sie das Becherglas in Aluminiumfolie ein und lassen Sie die Oberseite offen, um die Lösungsmittelverdampfung zu erleichtern Zum Sammeln der Nanopartikel beginnen Sie mit der Aufspaltung des Herzens in Nanopartikel in zwei Eichenkamm-Zentrifugenröhrchen mit einem Nennvolumen von 30 Millilitern und einem Abstand von 0,1 Gramm zueinander. Zentrifugieren Sie die Nanopartikel dann in einem Festwinkelrotor für 15 Minuten bei 17.000 Grad.

RC f. Längere Zentrifugationszeiten führen dazu, dass ein höherer Anteil kleinerer Nanopartikel gesammelt wird. Entsorgen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Nanopartikel-Pellet nicht zu stören.

Fügen Sie fünf Milliliter destilliertes Wasser hinzu und verwenden Sie ein Wasserbad, einen Ator und einen Wirbel, um die Nanopartikel vollständig zu suspendieren. Kombinieren Sie den Inhalt der beiden Zentrifugenröhrchen zu einem und fügen Sie 20 Milliliter destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 30 Millilitern zu erhalten. Wiederholen Sie dann die Zentrifugations- und Waschschritte noch zweimal für insgesamt drei Wäschen.

Das Flüssigkeitsvolumen der letzten Pellet-Resus-Suspension sollte vier bis fünf Milliliter betragen. Frieren Sie ein kleines Aliquot von telosfreien Nanopartikeln für die REM-Bildgebung für den Rest ein. Fügen Sie dem Polymer als Kryoprotektivum ein Gewichtsverhältnis von ein bis zwei TLO hinzu, um eine gleichmäßige und vollständige Wiederbelebungssuspension von PLGA-Nanopartikeln zu gewährleisten.

Dadurch wird verhindert, dass sich Eiskristalle bilden, die die Partikeloberfläche beschädigen und eine Aggregation induzieren können. Übertragen Sie die Nanopartikel in ein vorgewogenes Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und frieren Sie sie dann mindestens 30 Minuten lang bei minus 80 Grad Celsius ein. Öffnen Sie dann die Kappe des Röhrchens und decken Sie die Oberseite ab, indem Sie das Laborgewebe mit einem Gummiband über die Oberseite sichern.

Schnelles Bewegen, damit der Inhalt nicht schmilzt, wenn es zu einem Schmelzen kommt. Frieren Sie erneut ein, bevor Sie sie in den Gefriertrockner geben, und legen Sie die Fünf-Milliliter-Probe 72 Stunden lang lyophilisiert. Setzen Sie dann die Kappe wieder auf und umwickeln Sie das Röhrchen mit lyophilisierten Partikeln, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.

Legen Sie am Tag der Bildgebung einen Streifen doppelseitiges Kohleband auf einen REM-Stummel. Beschriften Sie den Metallteil des Stummels mit einem Permanentmarker zum späteren Nachschlagen. Verwenden Sie einen Metallspatel, um eine kleine Menge lyophilisierter Nanopartikel aufzufangen und sie vorsichtig auf der Oberfläche des Klebebandes zu verteilen.

Bürsten Sie die Oberfläche des Stummels mit Laborgewebe ab oder verwenden Sie Druckluft, um lose Nanopartikel zu entfernen. Die Visualisierung von Partikeln mit einem Arbeitsabstand von fünf bis 15 Millimetern Strahl, einer Stärke von fünf bis 12 Kilovolt und einer Punktgröße von ein bis drei höheren Strahlstärken kann zu einer regionalen Erwärmung der Probe führen, die die Oberflächenmorphologie der Partikel verändert. Mikropartikel werden bei 100-facher Vergrößerung beobachtet und Nanopartikel sind bei 3000-facher Vergrößerung unterscheidbar.

Konzentrieren Sie sich bei der Vergrößerung auf die Oberseite einer Kugel, um Partikel zu lokalisieren, die mit REM leicht visualisiert werden können, sammeln Sie mindestens drei Bilder pro Charge, um eine repräsentative Probe der Partikelgröße und -morphologie zu erhalten. Mit dieser Methode können Partikel durch eine einzelne Emotion erzeugt werden, die als einzelne, nicht verschmolzene Kugeln mit einer glatten Oberflächenmorphologie und einem breiten Größenbereich erscheinen, der über die Probe verteilt ist. Die hier gezeigten Mikropartikel haben einen durchschnittlichen Durchmesser von 730 Nanometern.

Hier sind Nanopartikel zu sehen, die von einer einzigen Emotion erzeugt werden und das hydrophobe Medikament Campin verkapseln. Diese Partikel wurden mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 340 Nanometern noch kleiner. Höhere Emulgatorkonzentrationen erzeugten kleinere Partikel mit durchschnittlichen Durchmessern, die von 2000 auf 200 Nanometer abnahmen.

Da stieg die Emulgatorkonzentration von 0,01 % auf 0,3 %, wie die REM-Bilder hier zeigen. Wenn jedoch die Konzentration von Vitamin E-T-P-G-S zu hoch war, bildeten sich bei Verwendung von 1%-VITAMIN E-T-P-G-S keine diskreten Partikel, da in der gesamten Struktur starke Fixier- und blattartige Strukturen gefunden wurden. STIMMT. Sobald Sie gelernt haben, wie man PLG-Nanopartikel durch Emulgierung herstellt, können andere Methoden wie die Oberflächenmodifikation durchgeführt werden, um Nanopartikel für die Interaktion mit bestimmten Zelltypen oder Körperregionen zu entwickeln.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man durch Emulgieren Partikel mit reproduzierbarer und einstellbarer Größe bildet.